p38 MAPK在大鼠脑缺血再灌注脑组织AQP4表达变化及脑水肿形成中的作用

王耀辉， 李国辉

脑缺血再灌注后脑水肿是缺血性脑卒中重要的病理过程，同时也是治疗缺血性脑卒中的关键，然而目前对脑缺血再灌注后脑水肿发生机制尚不完全清楚。水通道蛋白4(AQP4)广泛分布于中枢神经系统，在脑水肿的病理生理变化中发挥着重要的作用［1］。丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)信号通路是生物体内重要的信号转导系统，参与介导细胞生长、发育、分裂和分化等多种病理生理过程［2］。作为MAPK家族的一员，p38可在多种(缺血再灌注损伤、渗透压变化和生理应激等)病理生理条件下激活［3］，是脑组织损伤等病理改变的重要信号通路［4］。研究显示［5］，在液压冲击模型阻中，通过抑制p38磷酸化，可以降低星形胶质细胞AQP4的表达及细胞水肿程度。但p38 MAPK是否在脑缺血再灌注后脑组织AQP4表达及脑水肿形成中也发挥作用，国内外尚未见报道。本研究旨在观察大鼠脑缺血再灌注后脑组织磷酸化p38(p-p38)的水平，抑制p38的激活能否降低此过程脑组织AQP4的过表达及脑水肿程度，探讨其作用的机制。

1 材料和方法

1.1 主要药品和试剂 兔抗大鼠p38多克隆抗体、p-p38多克隆抗体及AQP4多克隆抗体(Santa Cruz)。羊抗兔IgG(北京中杉金桥)。p38特异性抑制剂SB203580(Selleck)。

1.2 实验动物分组和给药 SPF级雄性SD大鼠54只(体质量240～260g)，由广西医科大学实验动物中心提供，合格证号:SCXK(桂)2009-0002。随机分成3组:假手术组(sham组，n=18只)、缺血再灌注组(I/R组，n=18只)和p38抑制剂组(SB组，n=18只)。I/R组和SB组分别在制备大脑中动脉缺血/再灌注(MCAO/R)模型前15min通过舌下静脉注射10%DMSO(400μg/kg)和 p38抑制剂(SB203580，400μg/kg)。各组大鼠均于再灌注24h神经症状缺损评分后处死大鼠进行相关指标测定。

1.3 大鼠脑缺血再灌注模型的制备 改良大鼠大脑中动脉缺血/再灌注(MCAO/R)模型的制备:腹腔注射10% 水合氯醛(0.30ml/100g)麻醉大鼠，于左侧颈总动脉(CCA)分叉处分离颈外动脉(ECA)及颈内动脉(ICA)。双极电凝器凝断ECA及其分支，游离ECA主干，用眼科剪于ECA的远心端斜行45°剪一倒“V”小口并导入栓线。导入深度19～22mm，栓线头端恰好堵塞大脑中动脉(MCA)开口。术后2h拔出栓线，完成MCAO/R模型。假手术组:不做脑梗死，栓线插入深度＜9mm。若因造模失败或动物死亡等原因导致某实验组数目不足，通过随机抽样原则补齐动物数目。

1.4 大鼠神经功能缺损评分 大鼠脑缺血再灌注24h后，对其进行神经功能缺损评分。参照Zea-Longa法［6］:无神经功能缺损症状评0分;对侧前爪不能完全伸展评1分;向对侧转圈评2分;向对侧倾倒评3分;不能自发行走且意识水平下降评4分。造模成功的标志:大鼠麻醉苏醒后出现以前肢为重的缺血对侧肢体的偏瘫即神经功能缺损评分1～3分并且断头取脑后大脑中动脉无出血或血管内血栓形成。

1.5 脑组织含水量测定 大鼠脑缺血2h再灌注24h，麻醉后快速取脑，将脑组织放在垫有生理盐水浸湿滤纸的培养皿中。电子天平称湿重，然后将脑组织置于100℃恒温干燥箱中，烘干24～48h至恒重是为干重。计算含水量:脑含水量(BWC)=(湿重－干重)/湿重×100%。

1.6 Western blot检测脑组织 p-p38、p38 和AQP4的表达 大鼠脑缺血2h再灌注后24h，麻醉并迅速取脑，于冰上切取缺血周边区皮层脑组织，置于液氮中快速冷冻，－70℃保存待用。提取总蛋白后，制备SDS-PAGE凝胶，加样电泳。湿转法将蛋白条带转移至PVDF膜上，置入封闭液中(5%脱脂奶粉)常温封闭1h，封闭后加一抗(p38 1∶1000，p-p38 1∶1000，AQP4 1∶300)，4℃孵育过夜，加入 HRP 标记的二抗(羊抗兔 IgG，1∶1000)，37℃孵育1h，ECL 曝光、显影及定影，以β-actin作为内参。光片扫描后用Quantity One软件分析吸光度，p-p38/p38的吸光度比值A为p-p38的表达水平，AQP4/β-actin的吸光度比值A为AQP4的表达水平。

1.7 统计学处理 采用SPSS 19.0进行统计分析，计量资料采用均数±标准差()表示，神经功能缺损评分比较采用秩和检验，其余组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 神经功能缺损评估 与sham组相比，I/R组、SB组大鼠脑缺血再灌注后神经功能缺损症状不同程度加重(P＜0.05)。与I/R组相比，SB组大鼠神经功能缺损症状有所改善(P＜0.05)(见表1)。

2.2 脑组织含水量 sham组大鼠脑组织有一定的含水量。与sham组相比，I/R组和SB组大鼠脑组织含水量明显增加 (P＜0.05);与I/R组相比，SB组大鼠脑组织含水量明显减少(P＜0.05)(见表1)。

2.3 Western blot结果 sham组大鼠脑组织中p-p38和AQP4均有少量表达;与sham组相比，I/R组大鼠缺血周边区脑组织p-p38的水平明显上升(P ＜0.05)，AQP4的表达也明显上调(P ＜0.05);与I/R组相比，SB组大鼠缺血周边区脑组织p-p38的水平明显下降(P＜0.05)，AQP4的表达也明显下调(P ＜0.05)(见表2)。

表1 各组大鼠脑缺血再灌注后神经功能评分及脑含水量(n=6，)

表1 各组大鼠脑缺血再灌注后神经功能评分及脑含水量(n=6，)

与sham组比较△P＜0.05;与I/R组比较*P＜0.05

组别 神经功能评分 脑含水量sham组I/R组SB组0 2.33 ± 0.16△1.72 ± 0.18*0.776 ± 0.007 0.817 ±0.012△0.792 ±0.010*

表2 各组大鼠脑缺血再灌注后脑组织AQP4和p-p38表达(n=6，)

表2 各组大鼠脑缺血再灌注后脑组织AQP4和p-p38表达(n=6，)

与sham组比较△P＜0.05;与I/R组比较*P＜0.05

组别 例数AQP4 p-p38 sham组I/R组SB组666 1.224 ± 0.144 2.660 ± 0.130△1.771 ± 0.092*0.648 ± 0.096 2.463 ± 0.138△1.653 ± 0.105*

3 讨论

脑水肿是缺血性脑卒中重要的继发性脑损害，直接影响缺血性脑卒中患者的预后，是临床治疗脑卒中的关键。所以，如何预防和治疗缺血性脑卒中后脑水肿一直是临床研究的热点。

MAPK广泛分布于细胞的胞浆内，是细胞各种生物学反应的重要信号传导通路，它主要包括:p38、ERK1/2及JNK 3种亚家族成员。p38 MAPK可在多种(缺血再灌注损伤、渗透压变化和生理应激等)条件下激活［3］，并在神经系统炎症反应和细胞凋亡的调节中发挥重要作用［7，8］。Wallace 等［9］在大鼠脑缺血性卒中实验模型中发现，抑制p38的激活可以有效降低脑水肿的程度。Nito等［10］在体外星形胶质细胞实验中证实，抑制p38的激活可以降低星形胶质细胞AQP4的表达，减轻星形胶质细胞水肿的程度。

AQP4是维持脑组织水平衡的主要水通道蛋白，在脑内水平衡的调节中起到关键作用［11］。研究发现，在细胞毒性脑水肿模型中，敲除AQP4基因的大鼠与野生型大鼠相比，其星形胶质细胞足突肿胀及细胞毒性脑水肿的程度均明显减轻［12］，而在AQP4基因过表达的大鼠细胞毒性脑水肿模型中，其颅内压较野生型鼠明显增高［13］。此外，在其他细胞毒性脑水肿模型研究中［14，15］，也进一步证实AQP4的高表达与细胞毒性脑水肿密切相关。p38 MAPK是否对大鼠脑缺血再灌注后脑组织中AQP4的表达及脑水肿的发生发展起到关键作用，目前国内外鲜见报道。

我们的研究发现，大鼠脑缺血再灌注后缺血周边区脑组织中p-p38的水平明显增加，AQP4表达亦增高，脑组织含水量增加，脑水肿程度加重。与脑缺血再灌注大鼠相比，在造模前预先给予p38特异性抑制剂(SB203580)的大鼠缺血周边区脑组织中p38的磷酸化受到明显抑制，AQP4表达水平亦降低，脑组织含水量减少，脑水肿程度减轻。我们推断:由于脑缺血再灌注过程中p38 MAPK被激活，致使p-p38表达增高并介导其下游因子AQP4表达的上调，导致过多水分流入细胞内，脑水含量增多，脑水肿程度加重;p38特异性抑制剂抑制可抑制脑缺血再灌注过程中p38的过度激活，致使p-p38表达降低，进而有效下调AQP4的过表达，减少过多的水分流入细胞内，减轻脑水肿。

综上所述，抑制p38 MAPK在大鼠脑缺血再灌注过程中的过度激活，可下调AQP4的高表达，减轻脑水肿的程度，说明p38 MAPK在调节脑缺血再灌注大鼠脑组织中AQP4表达及脑水肿过程中发挥重要的作用。此研究结果为脑缺血再灌注后脑水肿的机制和临床靶点治疗的探索提供了新的线索，但具体的防治措施及分子机制有待于进一步的实验和研究。

［1］王海合，卢 红，丁继岩，等.β-七叶皂苷钠对大鼠局灶性脑缺血再灌注后AQP4蛋白表达的影响［J］.中风与神经疾病杂志，2012，29(6):534 －537.

［2］He QP，Ding C，Li PA.Effects of hyperglycemic and normoglycemic cerebral ischemia on phosphorylation of c-jun NH2-terminal kinase and p38 mitogen-activated protein kinase［J］.Cell Mol Biol，2003，49(8):1241－1247.

［3］李 雯，林江涛，孙力超，等.p38丝裂原活化蛋白激酶抑制剂SB203580对糖皮质激素敏感性的影响机制［J］.中华医学杂志，2012，92(36):2570 －2573.

［4］Sasaki N，Sekiguchi M，Kikuchi S，et al.Effects of asialoerythropoietin on pain-related behavior and expression of phosphorylated-p38 map kinase and tumor necrosis factor-alphainduced by application of autologous nucleus pulposus on nerve root in rat［J］.Spine，2011，36(2):86－94.

［5］Rao KV，Reddy PV，Curtis KM，et al.Aquaporin-4 expression in cultured astrocytes after fluid percussion injury［J］.J Neurotrauma，2011，28(3):371 －381.

［6］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rat［J］.Stroke，1989，20(1):84－91.

［7］周官恩，刘宗超，饶明俐，等.实验性脑出血后ICAM-1和IL-1的表达与p38MAPK通路关系研究［J］.中风与神经疾病杂志，2011，28(1):18 －20.

［8］张雪玲，齐晓岚，任家谋，等.SH-SY5Y神经细胞中α3神经型尼古丁受体对细胞凋亡及p38MAPK信号通路的影响［J］.中华病理学杂志，2013，42:116 －120.

［9］Wallace BK，Jelks KA，O’Donnell ME.Ischemia-induced stimulation of cerebral microvascular endothelial cell Na-K-Cl cotransport involves p38 and JNK MAP kinases［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2012，302(3):505 －517.

［10］Chikako Nito，Hiroshi Kamada，Hidenori Endo，et al.Involvement of mitogen-activated protein kinase pathways in expression of the water channel protein aquaporin-4 after ischemia in rat cortical astrocytes［J］.J Neurotrauma，2012，29(14):2404 －2412.

［11］Taya K，Marmarou CR，Okuno K，et al.Effect of secondary insultsupon aquaporin-4 water channels following experimental cortical contusion in rats［J］.J Neurotrauma，2010，27(1):229 －239.

［12］Papadopoulos MC，Verkman AS.Aquaporin-4 gene disruption in mice reduces brain swelling and mortality in pneumococcal meningitis［J］.J Biol Chem，2005，280(14):13906 －13912.

［13］Yang B，Zador Z，Verkman AS.Glia cell aquapofin-4 over expression in transgenic mice accelerates cytotoxic brain swelling［J］.J Biol Chem，2008，283(22):15280 －15286.

［14］Thrane AS，Rappold PM，Fujita T，et al.Critical role of aquaporin-4(AQP4)in astrocytic Ca2+signaling events elicited by cerebral edema［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2011，108(2):846 －851.

［15］Haj-Yasein NN，Vindedal GF，Eilert-Olsen M，et al.Glial-conditional deletion of aquaporin-4(Aqp4)reduces blood-brain water uptake and confers barrier function on perivascular astrocyte endfeet［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2011，108(43):1 －6.