H2-Calponin 蛋白在4种癌组织的表达及临床意义

李 玲，涂镇波，张永聪，陶 欢，单安祺，黎业源，周素芳

(广西医科大学 基础医学院，广西 南宁 530021)

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是广西常见恶性肿瘤，死亡率极高。其病因及发病机理复杂，是研究的热点问题之一。本实验前期利用SEREX 技术从人胚胎干细胞cDNA 文库中筛选出多个肿瘤相关抗原［1］，发现H2-Calponin 与肝癌相关，而目前国内外对H2-Calponin 在肿瘤中的表达鲜有报道［2－3］，其在肝癌组织中的表达分布未见相关文献，本研究利用免疫组织化学和原位RT-PCR探索肝癌相关抗原H2-Calponin 在不同癌组织中的表达，评估其作为肝癌诊断和治疗靶标的潜力。

1 材料与方法

1.1 临床资料

肝癌、肺癌、胃癌和鼻咽癌组织芯片(西安艾丽娜生物科技有限公司)各定购两张分别用于免疫组化和原位RT-PCR 实验，临床资料完整，所有病例术前未行放疗和化疗，术后均经病理证实。

1.2 主要试剂

兔抗人H2-calponin 抗体(Bioworld 公司)，Digox-dUTP(Roch 公司)，Mouse Anti-digox IgG-AP(北京中杉金桥生物技术公司)，H2-Calponin 引物(上海捷瑞生物工程有限公司)。

1.3 免疫组织化学SP 两步法

组织芯片常规脱蜡至水，高温高压进行抗原修复后3% H2O2溶液去除内源性过氧化物酶，山羊血清封闭非特异抗原，加入兔抗人calponin2 一抗(1∶200)4 ℃过夜，加入抗兔二抗(即用型)检测系统，DAB 显色，苏木素复染，镜下观察拍照。用已知阳性的肝癌组织切片做阳性对照，用PBS 代替一抗做阴性对照。

1.4 原位RT-PCR 检测肝癌组织中H2-Calponin mRNA 的表达

组织芯片常规脱蜡至水后胃蛋白酶消化，利用Oligo (dT)引物及AMV 反转录酶进行反转录后在原位PCR 仪上进行PCR，再加适量1∶300 Mouse Anti-digox IgG-AP，BCIP/NBT 显色并照相。将事先确定的阳性HCC 组织切片，用DNAse 消化过夜后，进行RT-PCR 反应，作为阳性对照切片;与阳性对照相同的HCC 组织切片不用DNAse 消化，直接进行普通PCR 反应，作为阴性对照切片;若阳性片为阴性可判断假阴性，若阴性片为阳性可判断假阳性。

1.5 阳性结果判定

免疫组织化学采用四级分法，即阳性细胞数≤25%为(+)，25%～50%为(+ +)，＞50%为(+ ++)，无阳性细胞(－);再结合染色强度，浅黄色为(+)，棕黄色(+ +)，棕褐色为(+++)，无着色细胞为(－)。两者合二为一进行分析判断，当两者均有(+ +)及以上时判定为阳性［4－7］。

原位PCR 实验结果阳性经盲法判定，当阳性颗粒超过所占视野50%时判定为阳性，每张拍片均由3 人分别判定，当两人以上判定为阳性时则认为此拍片为阳性。

1.6 统计学分析

采用SPSS13.0 统计软件对数据进行统计学处理分析，计量资料进行两样本比较t 检验，计数资料进行χ2检验。

2 结果

2.1 H2-Calponin 蛋白在4种不同癌组织中的表达分布

H2-Calponin 在肺癌、胃癌、鼻咽癌和肝癌组织中表达阳性率分别为30.0%、27.5%、45.0% 和51.8%，肝癌与肺癌、胃癌组之间阳性率有显著差异(P ＜0.05)(表1)。H2-Calponin 在HCC 细胞中表达较高，此外，在癌旁次生胆小管及血管周围也存在高表达，在细胞定位中H2-calponin 主要分布于胞质，偶见部分核染色(图1)。

2.2 肝癌不同临床病理特征的H2-Calponin 表达

按照肝癌患者的年龄、性别、肿瘤病理分级进行分组，采用χ2检验比较各组H2-Calponin 表达的阳性强度。发现H2-Cal-ponin 在不同分化程度的肝癌中均有表达，但伴有转移的肝癌组织中表达强度显著高于无转移者(P ＜0.05)(表2)。

表1 H2-Calponin 蛋白在4种癌组织中的表达Table 1 The expression of H2-calponin protein in four cancerous tissues

2.3 H2-Calponin mRNA 在4种不同癌组织中的表达

H2-Calponin mRNA 在肺癌、胃癌、鼻咽癌和肝癌组织中阳性率分别为17.5%、10.0%、20% 和50.0%。肝癌组织表达阳性率显著高于肺癌、胃癌、鼻咽癌组织(P ＜0.05)(表3)。H2-Calponin mRNA主要分布于细胞核周围(图2)。

表2 H2-Calponin 蛋白的表达与HCC 临床病理特征间的关系Tabel 2 Relationship between H2-Calponin protein expression and clinicopathological features of HCC

图1 免疫组织化学检测H2-Calponin 蛋白在4种癌组织中的表达Fig 1 Expression of H2-Clponin protein by Immunohistochemistry in four cancerous tissues(×400)

图2 原位RT-PCR 检测4种癌组织中H2-Calponin mRNA 的表达Fig 2 Expression of H2-Clponin mRNA by RT-PCR in four cancerous tissues(×100)

表3 H2-Calponin 蛋白在4种癌组织中的表达Table 3 The expression of H2-calponin mRNA in four cancerous tissues

3 讨论

H2-Calponin 是本研究新发现的肝癌相关抗原之一，前期研究发现H2-Calponin 蛋白在肝癌细胞系中高表达，在正常肝细胞系不表达［8］。本实验使用原位RT-PCR 以及免疫组织化学方法发现H2-Calponin 表达与肝癌关系密切，同时检测这4种相应正常组织(各8 例)的表达情况，发现此蛋白及其mRNA 在正常组织均有表达(由于例数较少，暂不进行统计分析)。研究病理资料发现，在54 例肝癌组织中伴有转移的有30 例，其中有19 例(63.3%)H2-Calponin 蛋白表达阳性，明显高于非转移组，提示H2-Calponin 表达在肝癌的转移过程中起到了重要作用。本实验表明，H2-Calponin 在肝癌发生转移时高表达，结合他人研究，提示H2-Calponin 蛋白在肿瘤的转移过程关系中起到了重要作用。本实验同时发现其在肝脏内血管周围表达较高，且在肝纤维化过程中表达亦稍高。有报道表明，H2-Calponin 不仅高表达于生长与成熟的平滑肌组织，同时也高表达于成纤维细胞［9］，用斑马鱼实验证明H2-Calponin在血管形成过程中起到了决定性的作用［10］，是否H2-Calponin 在肝癌伴转移中高表达与肝癌血管形成相关还有待进一步研究。

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