非肥胖糖代谢异常大鼠血清的代谢组学

辛衍代，臧学章，季 虹，荣海钦

(山东省医学科学院 内分泌与代谢病研究所，山东 济南 250062)

糖尿病是当前严重的全球性公共健康问题，其发病率近年来逐年上升，在中国成年人发病率达到了9.7%［1］，其并发症可致残致死，危害人们的健康。高糖高脂饮食导致的肥胖啮齿动物模型经常用来研究糖尿病的发病机理，即使相同基因背景的动物如Wistar 大鼠经过高脂饮食干预之后也会出现不同的表型-肥胖型和肥胖抵抗型［2］。代谢组学能对生物流体的代谢产物和代谢中间物进行定性定量分析，发现由疾病过程引起的代谢异常，还有助于发现疾病的生物标志物［3］。高糖高脂饮食导致的肥胖型2 型糖尿病方面已有大量的文献报道，但非肥胖型2 型糖尿病的研究还比较少，本研究对Wistar 大鼠进行高糖高脂饮食干预16 周，并对肥胖抵抗大鼠血清进行代谢指纹分析，筛选生物学标志物，对非肥胖性2 型糖尿病的发病机理有更深入的了解。

1 材料与方法

1.1 材料

甲醇(色谱纯，TEDIA 试剂公司)、吡啶(色谱纯，Fluka 公司)、正庚烷(色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司)、十七碳脂肪酸(98%，Alfa Aesar 公司)、BSTFA(Sigma-Aldrich 化学试剂公司)。

高糖高脂饲料20% 动物脂肪，5% 的葡萄糖，5%的果糖，5%的胆固醇，其他的为基础饲料。

清洁级体质量250 ±20 g，雄性Wistar 大鼠(山东大学实验动物中心，合格证号SCXK2009001)。

1.2 方法

1.2.1 模型复制:适应性喂养1 周后随机挑选7 只大鼠喂养基础饲料，作对照组(CR)，随机选21 只喂养高糖高脂饮食，16 周后称体质量，按照体质量增加量再次排序，上1/3大鼠(7 只)为肥胖组大鼠，与中间1/3大鼠(7 只)均剔除，下1/3大鼠(7 只)为肥胖抵抗组大鼠(OR)［4］，尾静脉采血，测生化指标，并对血清做代谢指纹分析。

1.2.2 样品前处理:100 μL血清加入到770 μL甲醇中，加入 混合标 样30 μL (十七 碳 酸，浓 度0.20 g/L)，震 荡 超 声30 s，－20 ℃放 置10 min，4 ℃，10 000 r/min，离心10 min，取上清液600 μL，真空干燥，加入50 μL甲氧胺的吡啶溶液(15 g/L)，25 ℃肟化16 h，加40 μL BSTFA，70 ℃衍生30 min，加70 μL正庚烷混匀，离心取上清，准备分析。

1.2.3 分析条件:进样量:2 μL;分流比10∶1;色谱柱:DB-5 MS(30 m ×0.25 mm ×0.25 μm);柱温:70 ℃(2 min) →7 ℃/min－180 ℃→5 ℃/min－250 ℃→25 ℃/min－290 ℃，持续10 min;进样口温度:270 ℃;接口温度:280 ℃;离子源温度:230 ℃;载气:氦气;载气流速:40 cm/s;电离方式:EI;电子能量:70 eV;扫描范围:40～500 m/z。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 生化指标

高糖高脂饮食干预16 周之后，肥胖抵抗组血糖、低密度脂蛋白、总胆固醇显著升高，高密度脂蛋白显著下降，空腹胰岛素及胰岛素抵抗指数显著升高，而三酰甘油却显著下降(P ＜0.05)(表1)。

表1 肥胖抵抗组和对照组生化指标Table 1 Biochemical criteria of Obesity resistant group and control group

图1 大鼠血清的主成分分析得分图Fig 1 PCA of metabolites in rats serum

2.2 GC-MS 分析结果

图1 说明本实验的分析误差小于样本间的固有差异，正常组大鼠和肥胖抵抗组大鼠分别在不同的区域，具有较大的差别。模型的R2Y 和Q2值分别为0.836 和0.772，模型具有较好的预测能力。过拟合测试中R2截距和Q2截距分别为0.292 和－0.215，模型不存在过度拟合［6］，最终得到24 个代谢物在正常对照组和模型组之间有显著性差异(P ＜0.05)(表2)。

3 讨论

糖尿病是一种由多种因素导致的代谢性疾病，它的发生发展伴随着糖类、蛋白质及脂类等化合物的异常代谢。高糖高脂饮食导致Wistar 大鼠血糖、血脂代谢紊乱，胰岛素分泌增加并发生胰岛素抵抗，模型复制成功。胰岛素抵抗和2 型糖尿病常伴有脂代谢紊乱，如高TG、LDL 及FFA 升高，HDL 降低［7］，可以诱导内皮损伤和一系列炎性反应，而引起动脉硬化。血浆中游离脂肪酸水平在诱导胰岛素抵抗和细胞功能减退方面有重要影响［8］。实验组TG 显著减少，游离脂肪酸十四碳酸水平较对照组有所下降，这和肥胖型2 型糖尿病的脂肪酸代谢轮廓不一致［9］，具体的机理还需进一步的研究。

胰岛素抵抗减弱糖酵解，糖酵解产物丙酮酸会减少［10］。柠檬酸、苹果酸、延胡索酸、琥珀酸等三羧酸循环主要中间代谢物减少表明葡萄糖的有氧代谢减弱。尿酸是体内核酸中嘌呤的代谢终产物，与内皮功能失调、氧化代谢及血小板黏附、聚集功能异常有关，是心血管疾病的潜在危险因素［11］。

表2 肥胖抵抗组和对照组差异代谢物Table 2 The differential metabolites between obesity resistant group(OR)and control group(CR)

肥胖抵抗大鼠血清的多种氨基酸的含量发生变化，与大鼠葡萄糖代谢受损时氨基酸的氧化成为重要的替代能源有关。当胰岛素和胰高血糖素之间的平衡打破之后，氨基酸便成为糖异生的重要前体，同时胰岛素的分泌不足也能直接促进氨基酸的糖异生进而影响血糖浓度。

综上所述，通过对肥胖抵抗大鼠和对照大鼠的血清进行了代谢组学研究，运用PCA 和PLS-DA 对数据分析寻找潜在生物标志物，并利用NIST 质谱数据库鉴定代谢物，发现多个糖代谢、脂代谢、蛋白质代谢相关代谢物浓度异常，表明在经过高糖高脂饮食干预之后肥胖抵抗大鼠的能量代谢紊乱，对非肥胖型2 型糖尿病的发病机理的研究有重要意义。

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