花生过敏原结构及加工研究进展

韩远龙，吴志华*，李 璞，李西莹，陈红兵

(1.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，中德联合研究院，江西 南昌 330047；2.南昌大学环境与化学工程学院，江西 南昌 330047；3.北京林业大学生物科学与技术学院，北京 100083)

在美国，食物过敏影响着6%～8%的4岁以下儿童和4%的10岁以上的人群[1]，被WHO/FAO认证的8大类过敏食物能被90%的食物过敏患者识别[2]，据报道[3]，花生过敏占食物过敏的10%～47%，花生所引起的过敏严重影响了部分人群的生活质量。中国协和医科大学[4]调查表明，北京地区约有4%的食物过敏患者对花生过敏。2010年，有关加拿大第一个全国性的调查证实花生过敏症的患病率为0.61%[5]。而且花生过敏通常是终生的，只有10%的过敏儿童会随年龄的增长产生耐受性[6]。正是由于其严重危害性而备受关注。近几年来，花生过敏的发病率随着花生消费的增加而增大，而对于花生过敏的治疗，目前尚无特效疗法，严格避免食入含花生的食物成为了这些患者的最佳选择。为避免无意摄入，就需要对食物中过敏原蛋白进行检测和标示，而通过加工降低甚至消除食物的过敏原性则是解决食物过敏原的另一条主要途径。

就花生过敏原蛋白而言，有关其检测和纯化等研究的进展已有综述[7-8]，本文主要介绍花生过敏原蛋白结构和加工的相关研究进展。随着对花生过敏原蛋白结构研究的深入，通过加工改变其结构，探索过敏原可消化性和过敏原性的改变，成为研究的热点之一。

如表1所示，目前发现花生过敏原蛋白有11种，其中Ara h 1和Ara h 2被认定为2种主要的过敏原，它们能够被90%以上的花生过敏患者血清IgE所识别[9]。近年来，包括花生主要过敏原蛋白在内的各种过敏原研究都取得了较大进展，更清楚地揭示了其结构，有关加工对其过敏原性等性质的影响也更明确。

表1 主要花生过敏原[10]Table 1 Major peanut allergens[10]

1 花生主要过敏原Ara h 1研究进展

Ara h 1是花生过敏原中含量最高的过敏蛋白，占花生蛋白总量的12%～16%，天然状态是以三聚体形式存在，其单体是分子质量为63.5kD的糖蛋白[11]，等电点为4.55，在天然状态下是可溶性蛋白，热稳定性强，属于Cupin家族内的豌豆球蛋白，它与豌豆球蛋白的氨基酸序列相似性为40%，与蚕豆蛋白的核苷酸序列相似性达到64%[12]。Ara h 1含有23个过敏原表位，其中4个表位能被80%以上的过敏患者IgE识别，Ara h 1因其耐酶解且能激活树突状抗原呈递细胞而导致机体发生过敏反应[13]。

1.1 Ara h 1结构

通过BLAST(basic local alignment search tool)相似性分析，Ara h 1蛋白序列内含有2个Cupin结构域，利用生物信息学的同源建模方法构建Ara h 1蛋白的空间三维结构，发现Ara h 1单体的羧基端是由反平行β-折叠片组成的β桶状结构和由α-螺旋组成的环状区构成[14]。通过对重组Ara h 1蛋白片断的X光晶体衍射分析，Ara h 1的核心结构与7S球蛋白非常相似，而且大多数的线性表位存在于扩展的环状区域中，这些表位能影响三聚体的形成，也正是这些表位，使得Ara h 1可在肠道中完全或部分消化成碎片。Yan Yongsheng等[15]的研究中，从花生子叶提取RNA，构建cDNA库，测序分析随机克隆的400多个克隆子，发现其推导出的Ara h 1多肽含有2个Cupin结构域，这种结构域与Ara h 3具有99%的相似性。这些对过敏原蛋白结构的揭示，为利用各种加工手段降低甚至消除其致敏性奠定了基础。

1.2 加工对其过敏原性的影响

有关通过加工来降低或消除Ara h 1过敏原性的探索较多。热加工是改变蛋白质性能最普遍的方法，虽然当纯化后的Ara h 1加热到80～90℃时，二级结构折叠加剧，使得溶解度降低[16]。但是，高温变性的Ara h 1蛋白仍然具有天然Ara h 1蛋白相类似的IgE结合活性，说明高温条件并没有破坏Ara h 1的主要过敏原结构，因此，Ara h 1是耐热的[17]。而经过水煮后，IgE 的结合能力比生花生要降低一半，这与花生结构的改变无关，主要是由于部分过敏原如 Ara h 1和Ara h 2等进入了水中，尤其是一些10～16kD的低分子质量蛋白质或肽片断溶解到水中，从而降低了花生的过敏性[18]。Blanc等[19]研究也表明，煮沸后，Ara h 1聚集起来，蛋白的二级结构部分丢失，导致过敏原性降低。煎炸同样会影响其过敏原性，花生经煎炸后所含的Ara h 1单体和三聚体数量就会减少，从而降低Ara h 1与IgE的结合能力，影响其过敏原性。

非热加工也被用于改变Ara h 1过敏原性。酶法改性技术是非热加工中的一种，主要包括酶水解和酶交联。Koppelman等[20]在花生消化性实验评估中，用胃蛋白酶和胰蛋白酶消化花生过敏原，发现Ara h 1、Ara h 3能迅速被胃蛋白酶消化，而Ara h 2和Ara h 6，即使在很高的胃蛋白酶浓度条件下也很难被消化，而且用胰蛋白酶消化Ara h 2仍有大量肽段，所以Ara h 2、Ara h 6比Ara h 1、Ara h 3更难消化。Yu Jianmei等[21]的研究表明，胰蛋白酶和糜蛋白酶水解能有效降低花生过敏原Ara h 1和Ara h 2的含量，还能增加可溶性蛋白的含量，并且煮沸能提高酶水解烘烤花生的效率，但这对生花生的影响不大。还有研究表明天然Ara h 1(nAra h 1)比重组表达Ara h1 (rAra h 1)在胃肠消化时更稳定，而且它们与IgE的结合形式也不同[22]，因此，rAra h 1比nAra h 1更适用于花生过敏的诊断。除了消化酶外，其他水解酶也能改变其过敏原性，研究表明，碱性内切蛋白酶比风味蛋白酶能更好地水解可溶性烘烤过的花生蛋白提取液，进而减少其与IgE的反应性[23]。

酶交联技术是食品非热加工中的一种新方法，其原理是利用一种或多种酶催化蛋白质内部各多肽链之间，或催化蛋白质各分子之间形成共价键而发生交联反应，改变了原有蛋白质的空间结构，从而影响了原有蛋白质的许多功能特性。Chung等[24]研究表明，在37℃分别用过氧化物酶处理焙烤花生和生花生60min后，烘烤花生的Ara h 1和Ara h 2明显减少，IgE结合能力减弱，而对于生花生则没有影响。而经多酚氧化酶交联后，无论是生花生，还是烘烤过的花生，粗蛋白中Ara h 1和Ara h 2明显减少，并形成了高聚物，虽然交联产物也会与IgE结合，但是总IgE水平是降低的[25]。Ara h 1被转谷氨酰胺酶交联修饰后，其致敏性变化不大，这是由于疏水氨基酸主要位于Ara h 1单体相互作用的区域，Ara h 1单体可以聚合成高度稳定的同源三聚体，大部分IgE结合位点也位于单体的结合区域，这有利于保护IgE结合位点，使其不易被蛋白酶识别[26]。

2 花生主要过敏原Ara h 2和Ara h 6研究进展

根据Uniprot蛋白质数据库分析，Ara h 2是一种含有172个氨基酸的蛋白，属于2S种子贮藏蛋白家族，分子质量为17～20kD的同种异型蛋白，其pI值为5.2，占花生蛋白总量的10%左右[27]。Ara h 6也属于2S种子贮藏蛋白家族，分子质量为15kD，与Ara h 2有59%的同源性，特别是其基因序列的中部和C端与Ara h 2的同源性更高，同样含有5个二硫键，是胰蛋白酶和糜蛋白酶的抑制剂。已有报道[28]至少部分Ara h 6表位能与Ara h 2表位发生交叉反应。

2.1 Ara h 2和Ara h 6结构

Ara h 2是由前体蛋白经过翻译后修饰、剪切，成为成熟的单链蛋白[29]，Ara h 2的空间三维结构是由环连接的5个α-螺旋形成的右手超螺旋结构及一段反向平行的β-折叠组成，该β-折叠由一小段蛋白环相连，8个半胱氨酸形成的4个保守的二硫键是稳定高级结构的主要作用力，IgE的结合位点位于Ara h 2空间高级结构的表面[30]，Ara h 2共有10个IgE结合表位，其中位于aa27～36、aa57～66和aa65～74位置的3个表位与IgE的结合能力比其他表位都强，被认为是Ara h 2蛋白的优势表位[31]。Ara h 2 有Ara h 2.01和Ara h 2.02两个亚型，Ara h 2.02比Ara h 2.01多1个由12个氨基酸构成的IgE结合表位，因此其致敏性可能更严重[32]。Ara h 2被认为是最强的花生过敏原，它引起组胺释放及皮内测试反应的含量都只需Ara h 1的1%[33]。晶体衍射结果[34]表明，Ara h 2由5螺旋被4个二硫键捆绑在一起，这种结构与淀粉酶和胰蛋白酶抑制剂很相似。因此Ara h 2也具有胰蛋白酶抑制剂的活性，并且经过烘烤处理后，Ara h 2蛋白的抑制剂活性被显著提高[35]。

朱盼等[36]对Ara h 6免疫交叉反应性研究得出，与Ara i 6、落花生Conglutin、Ara d 6和落花生Conglutin 8在序列同源性、线性表位和构象型表位上都有很高的相似性，它们与Ara h 6发生交叉反应的概率为100%。Ara h 1、Ara h 2和Ara h 3的全序列已被表征，而只有Ara h 6.0101被部分表征[37]，Ara h 6在花生中含量很低，约占花生蛋白总含量的4.5%[38]，但有很强的致敏性。Bernard等[39]在研究中发现，对Ara h 6的酶联免疫吸附实验中超过94%的患者血清显阳性，而在皮肤点刺实验的8位患者中有7位对Ara h 6显阳性。罗春萍等[40]用阴离子交换层析一步法从花生蛋白中分离纯化出Ara h 6，纯度大于95%，得率为22.5%。该法简单、高效、成本低，为开展该蛋白的结构与功能研究提供良好的原材料。夏立新等[41]比较Ara h 2和Ara h 6的生物信息，发现两者从一级结构到三级结构均极为相似，奠定了两者交叉反应的分子基础，同时，Ara h 2的一段特有氨基酸序列(60～73)发挥了重要作用，该段序列可能是造成 Ara h 2与Ara h 6变应原活性差异的根本原因之一。

2.2 加工对其过敏原性的影响

Ara h 2和Ara h 6的过敏原性也可以被各种加工方法改变。其中热加工也是改变Ara h 2和Ara h 6过敏原性的重要手段。研究表明[42]，Ara h 2蛋白经低于70℃的热处理后，其抗原性略有增强，而不同加工时间对蛋白的抗原性影响不大。当热处理温度高于85℃时，过敏原Ara h 2的抗原性明显降低。经115℃热处理60min后，其抗原性降至最低。Vissers等[43]的研究表明，加热能降低生花生Ara h 2和Ara h 6与IgE的反应能力和性能，而烘烤后分离纯化得到的Ara h 2和Ara h 6，其与IgE结合能力及其天然蛋白性能仍保留。但Stark等[44]研究说明，加热明显提高Ara h 2与人体肠道上皮细胞的结合，加速低聚体形成，提高其与IgE和IgG结合能力。焙烤过程中，Ara h 2分子发生了交叉连接，并形成结构更稳定的三聚体或六聚体等复合物，增强其与IgE 的结合能力。水煮过程中Ara h 2蛋白分子进入了水中后，有一些10～16kD的低分子质量蛋白质或肽片断溶解进入水中，从而会降低花生的过敏性。煎炸过程中过敏原Ara h 2的含量并未减少，但Ara h 2与IgE的结合能力却下降了。

非热加工也能够影响Ara h 2和Ara h 6的过敏原性。Hu Chunqiu等[45]分别用3种不同加工方法处理Ara h 2，以改变Ara h 2的抗原性。其中以辐照处理对Ara h 2的抗原性降低最为明显，20kGy的辐照剂量即可使Ara h 2的抗原性降低93%。其次为热加工处理，当热处理温度高于85℃时，过敏原Ara h 2的抗原性明显降低，当处理温度为115℃时，加热1h，其抗原性降低85%。超高压微射流对于改变Ara h 2的抗原性影响最小，当Ara h 2经180MPa处理3次时，其抗原性降低了51%。而Johnson等[46]研究表明Ara h 2和Ara h 6在80℃超高压条件下和脉冲电场处理后均无明显变化。罗春萍[47]用辐照和超高压微射流处理Ara h 6时，该蛋白的二级结构发生明显变化，蛋白结构展开，疏水性增强，破坏了Ara h 6的表位，使得抗原性降低，且辐照使Ara h 6聚集成多聚体，因此，辐照引起抗原性变化比超高压微射流更显著。

2.3 其他方法对其过敏原性的影响

从基因工程的角度出发也可以改变花生的过敏原性，Ramos等[48]对Ara h 2.01上5个不同位点进行错义突变得到的Ara d 2.01，IgE结合能力降低了56%～99%。Chu等[49]采用RNA干扰沉默Ara h 2和Ara h 6基因，发现该方法也是一种可行的生产低致敏花生的方法。易海涛等[50]利用基因工程技术将Ara h 2进行合理组合，将其序列进行合成，改造后的Ara h 2蛋白(S-Ara h 2)与重组Ara h 2(R-Ara h 2)蛋白相比，结合花生过敏病人混合血清，IgE水平显著降低。用壳聚糖包裹重组Ara h 2制备的重组Ara h 2壳聚糖纳米粒能明显降低血清特异性IgE和血浆组胺水平，因此具有抗花生过敏的显著疗效[51]。由于Ara h 6是胰蛋白酶抑制剂，选择性破坏Ara h 6二硫键能使酶解产物IgE结合能力消除和肥大细胞脱颗粒的能力降低[52]。选择性单独移除花生粗蛋白中的Ara h 2或Ara h 6并没有降低花生的效应活力，而同时移除花生粗蛋白的Ara h 2和Ara h 6其效应活力明显降低，IgE结合能力明显下降[53]。

3 花生过敏原Ara h 3/4相关研究进展

Ara h 3单体由氨基端结构域和羧基端结构域构成，这2个结构域内各有1个保守的Cupin折叠(Cupin折叠结构是由两组反平行β-折叠片、无规则环和3个α-螺旋组成)[54]，62%～72%序列与大豆球蛋白(大豆和豆科蛋白)相同。经诱导的Ara h 3氨基酸序列显示其与11S种子贮藏蛋白的同源性很高，Rabjohn等[55]克隆出Ara h 3的基因，并在原核系统中表达出此重组蛋白，其能被45%的花生过敏患者血清的IgE所识别。有研究[56]显示，Ara h 3可被水解为1个酸性片段和1个碱性片段，再进一步被胰蛋白酶消化产生13～45kD大小不等的片段，这些片段中含有的IgE结合位点即可导致机体发生过敏反应。Restani等[57]研究发现，病人主要的过敏反应是由Ara h 3中的碱性亚基引起的，“GT-C9”突变体缺失了Ara h 3蛋白的碱性多肽链导致其致敏性消失或减弱，这说明Ara h 3蛋白的碱性多肽链具有致敏作用[58]，已知Ara h 4的分子质量为61kD，为53%的花生过敏患者所识别[59]。在一级结构上Ara h 4和Ara h 3有91%的氨基酸残基相同[60]，它们的等电点也都为5.5，因此，它们被认为是同源过敏原，统称为 Ara h 3/4[61]。目前，改变Ara h 3/4过敏原性的研究报告较少，钟海峰等[62]克隆表达的Ara h 3的一种亚型(iso-Ara h 3)，其血清IgE识别率为12.5%,是一种低过敏原性的过敏原蛋白。

4 其他花生过敏原蛋白相关研究进展

Ara h 5是植物肌动蛋白中的一种，pI值为4.6，只有13%～16%过敏患者IgE能识别。Cabanos等[63]采用硫酸铵沉淀和凝胶层析将其从花生中分离纯化出来，与其他肌动蛋白Phl p 12 和 Bet v 2一样有交叉反应，并且比这两者的IgE结合能力更强。因此可以作为肌动蛋白过敏原诊断的模型。

Ara h 7已检测到有2种亚型[64]，即Ara h 7.0201和Ara h 7.0202，其中Ara h 7.0201含有8个半胱氨酸残基。Ara h 7.0202可能有淀粉酶和胰蛋白酶抑制剂的功能。Ara h 8与Bet v 1有交叉反应且热稳定性不强，易于消化，Mittag等[65]的研究将其命名为Ara h 8.0101。2008年，Riecken等[66]采用三步法(一步凝胶层析和两步离子交换层析)从花生中分离纯化出Ara h 8的另一个亚型，即Ara h 8.0201。DNA测序表明，两者的相似度仅为51.3%。易海涛等[67]也成功地克隆并表达纯化了花生过敏原Ara h 8，表达蛋白具有良好的免疫原性。Ara h 9是一种非特异性脂质转移蛋白，Lauer等[68]采用三步法从花生粗蛋白纯化出来，其IgE结合能力与rAra h 9相似，rAra h 9与桃过敏原Pru p 3有很强烈的交叉反应，因此Ara h 9是地中海花生过敏患者的主要过敏原。Ara h 10、Ara h 11都属于油质蛋白(oleosins)，Cabanos等[69]首次开发了一种新型的纯化和表达系统，包含花生3种油质蛋白(14、16、18kD)纯化和表达系统，发现重组表达的油质蛋白与天然的油质蛋白非常类似。

5 结 语

花生是一种高脂肪、高蛋白的食品，营养丰富，但由于其致敏反应的严重危害性和长期性，使得花生产品的开发推广受到限制，给花生致敏患者的食品安全带来重大风险。通过对花生过敏原蛋白性质的深入研究，对其三维结构的揭示和过敏原表位的定位等，都为加工降低其过敏原性奠定了基础。各种加工手段，包括热加工、生物加工以及其他非热加工手段，都被用于降低甚至消除花生过敏原蛋白的致敏性尝试。在研究中，不同加工手段对不同蛋白质的致敏性、可消化性的影响各不相同，目前尚未找到加工对花生过敏原性影响的规律，这一规律的总结仍然有待更多实验数据，加工过程中过敏原结合表位的变化值得重点探究。另一方面，在探索加工对花生过敏原性影响的工作中，多采用单个蛋白进行加工而不是在花生基质中进行研究，这在简化研究体系的同时，也使得理论研究与实际情况差距变大。直接探索花生加工时，处于花生基质中的过敏原蛋白结构和性质变化，可以为花生加工方法的选择提供更加准确的理论依据。

对花生过敏原蛋白性质的深入探索，以及加工对过敏原性的影响研究，都以实现脱敏花生的生产为目标。这些研究能为过敏原食品的普遍应用奠定基础，在丰富食物过敏患者食品选择的同时，有效降低食品安全风险。

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