水通道蛋白-5基因多态性与中国北方汉族人群慢性阻塞性肺疾病的相关性分析

刘魁，冯凯，王萍，贾海英，任家庭，路浩军，彭文鸿

水通道蛋白-5基因多态性与中国北方汉族人群慢性阻塞性肺疾病的相关性分析

刘魁，冯凯，王萍，贾海英，任家庭，路浩军，彭文鸿

目的探讨水通道蛋白-5(AQP5)基因多态性与中国北方汉族人群慢性阻塞性肺疾病(COPD)的遗传易感性及严重程度的关系。方法2007年6月－2012年5月在解放军306医院呼吸科获得诊断的COPD急性加重(AECOPD)患者220例，男142例，女78例，年龄37～101(74.0±10.0)岁，选取在我院进行体检，且年龄、性别与COPD患者相匹配的285例健康人群列入对照组，男183例，女102例，年龄44～97(72.5±8.6)岁。将COPD组分为4个亚组：第1秒用力呼气容积占用力肺活量百分比(FEV1/FVC)＜70%，第1秒用力呼气肺容积占计值百分比(FEV1%)≥80%为轻度组；50%≤FEV1%＜80%为中度组；30%≤FEV1＜50%为重度组；FEV1≤30%为极重度组，将轻度与中度合并为轻-中度组，重度与极重度合并为重度-极重度组。搜集研究对象外周血标本，采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)和SNaPshot法检测AQP5基因3个标签单核苷酸多态性(tSNP)位点(rs3736309，rs296754和rs296759)的基因型分布。采用χ2检验进行Hardy-Weinberg平衡检验，用非条件logistic回归模型计算比数比(OR)及95%可信区间(CI)。比较AQP5 3个tSNP基因型频率分布在健康对照组和COPD患者间的差异，以明确AQP5基因多态性与中国北方汉族人群罹患COPD的相关性。比较轻-中度与重度-极重度COPD患者AQP5基因多态性的差异，以进一步明确AQP5基因多态性与COPD严重程度的关系。结果AQP5基因rs3736309、rs296754和rs296759位点基因型分布在COPD患者与对照组中无明显差异。但在COPD患者中，rs3736309在轻-中度与重度-极重度患者中基因型分布的差异有统计学意义(P＜0.05)，提示rs3736309多态性位点可能与COPD患者气道阻塞严重程度相关。结论AQP5基因多态性与COPD的易感性无关，但与COPD的肺功能损害严重程度有关。

肺疾病，慢性阻塞性；水通道蛋白-5；多态性，单核苷酸

慢性阻塞性肺疾病(ch ron ic obstru c tive pulmonary disease，COPD)是一种以气流受限持续存在且呈进行性发展为特征的慢性疾病，发病率和病死率在全世界范围内都逐年升高[1-2]。COPD的发病除与吸烟、环境污染等因素有关外，与多种基因的遗传易感性也有关[3-5]。水通道蛋白-5(aquaporin5，AQP5)是一种转运水分子的跨膜结合蛋白，主要参与水的转运，维持细胞内外水平衡，并参与调节肺脏黏液、唾液分泌以及泪液的产生，与肺功能密切相关。本研究以AQP5为候选基因，采用标签单核苷酸多态性(tag single nucleotide polymorphism，tSNP)的方法对其进行关联研究，以探讨AQP5基因多态性与COPD遗传易感性及疾病严重程度的关系。

1 资料与方法

1.1研究对象 搜集2007年6月－2012年5月在解放军306医院呼吸科住院治疗的COPD急性加重(acute exacerbations of chronic obstructive pulmonary disease，AECOPD)患者的外周血样本。其中COPD组220例，男142例，女78例，年龄37～101(74.0±10.0)岁，诊断符合COPD最新诊治指南[1]。对照组为在我院进行体检且年龄、性别与COPD患者相匹配的健康人群，共285例，男183例，女102例，无心、肺、脑、肝、肾等重大疾病，年龄44～97(72.5±8.6)岁。将COPD组根据肺功能测试结果将气道受限的严重程度分为4个亚组：第1秒用力呼气容积占用力肺活量百分比(FEV1/ FVC)＜70%，第1秒用力呼气肺容积占计值百分比(FEV1%)≥80%为轻度组；50%≤FEV1%＜80%为中度组；30%≤FEV1＜50%为重度组；FEV1≤30%为极重度组[1]。在后续分析时将轻度组与中度组合并为轻-中度组，将重度和极重度组合并为重度-极重度组。所有参与者均签署知情同意书，经解放军306医院伦理委员会认可。

1.2材料方法

1.2.1标本获取 于次日抽取所有入选患者外周静脉血2m l，用于提取基因组DNA。

1.2.2DNA提取 采用酚-氯仿法从患者外周血中提取基因组DNA，于－70℃保存备用。

1.2.3tSNP选择 参考序列取自人类单体型计划数据库(Chr12：48639886－48650885)，共11kb，包括AQP5的5'区、全部3个外显子区、4个内含子区和少量3'区。这一区域的dbSNP共8个(http://snp. cshl.org/cgi-perl/gbrowse/hapmap24_B36/)，采取Tag SNP Picker程序确定rs3736309(S1)、rs296754(S2)和rs296759(S3)作为tSNP用于基因型分析，参数为r2大于0.8，最小等位基因频率(MAF)大于0.05。

1.2.4基因型分析 rs3736309基因型分析采用限制性片段长度多态性法，以Prim e3软件设计引物[生物工程(上海)股份有限公司合成]，P1'为5'-ATTCTGTGGGAGTGGACCAG-3'，P2'为5'-GGTTCAGGCCATACAAAGC-3'，扩增长度为341bp。PCR反应体系(25μl)：25ng基因组DNA，dNTP(各10mmol/L)，10×缓冲液，引物各5pmol，E×TaqDNA聚合酶1U，以上试剂均购自宝生物工程(大连)有限公司。PCR条件：94℃预变性5m in；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；最后72℃ 延伸7m in，4℃保存。以上反应在基因扩增仪(PE 9700型，ABI公司)上进行。PCR产物用XbaI内切酶(Promege公司)酶解，酶切产物(245bp和106bp)行琼脂糖凝胶电泳，并于紫外透视仪上观察电泳条带，判断基因型。分型结果经直接测序法加以验证(北京三博远志生物技术公司)。

rs296754和rs296759基因型分析采用SNaPshot技术进行(北京阅微基因技术公司)。以Prim ier 3软件设计引物及延伸引物。rs296759预扩增引物：正义GTGTGGGTTTCTATTAACACGACT；反义TATCTGCAAAACAGGGGTACTT；延伸引物为ttttt tttttTCGTGAGGAGAAAATGAGACCA；rs296754预扩增引物，正义GGACGAATATACTGACACACCAC T；反义GTGTCCCCTCTGAAGGTTTATT。延伸引物为tttttttttttttTAGACCCTCAAAGAAGGCAAAC。

预扩增PCR反应和扩增产物纯化：PCR反应体系10μl，包括10×缓冲液1μl，0.2μl dNTP混合物(10mmol/L)，0.1μl HotstarTaqDNA聚合酶(5U/μl,KAPAbiosystems公司)，PCR引物(10pmol/L)各0.2μl和1μl DNA模板(20mg/L)。反应程序：95℃ 5min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s，32个循环；72℃8m in，结束后4℃保存。PCR扩增后，取PCR反应产物2μl行2%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物纯化：每个样本取预扩增产物3μl，共15μl混匀，加入5U SAP(Fermentas公司)和2UExoⅠ(NEB公司)，震荡混匀，37℃保温1h，然后75℃保温15m in灭活SAP和ExoⅠ酶。

SNaPshot反应：取纯化好的PCR产物1μl，每条浓度为0.2μm ol/L的延伸反应引物混合物，与Ready Reaction M ix (含AmpliTaqDNA多聚酶和不同荧光标记的ddNTP)组成一个10μl PCR反应体系。反应程序：96℃变性10s；96℃变性10s，50℃退火5s，60℃延伸30s，27个循环；60℃延伸30s，结束后4℃保存。延伸产物纯化：在10μl延伸产物中加入1U SAP，37℃温浴1h，75℃灭活15min。

DNA测序仪测序：在96孔板中每孔加入9μl高纯甲酰胺(Hi-Di Formam ide)，0.5μl分子量内标GeneScan-120 LIZ Size Standard(ABI公司)和0.5μl纯化的延伸产物，总体积10μl。95℃变性3m in后，在DNA序列检测仪(3730XL型，ABI公司)上进行毛细管电泳，采用GeneMapper 4.0软件分析实验结果。为保证结果准确性，随机抽取5%样本进行直接测序验证SNaPshot方法的准确性。

1.3研究指标 搜集患者的一般情况和基因分析结果，对两组的基线指标[年龄、性别构成比、体重指数、吸烟人数的构成比、吸烟指数和病程(疾病第一次诊断到此次发病时间)]进行对比。对SNP的rs3736309(S1)、rs296754(S2)和rs296759(S3)基因型在两组患者中的分布进行Hardy-Weinberg平衡检验，以便确认基因型鉴定的准确性。为分析AQP5基因多态性与中国北方汉族人群COPD的关系，对AQP5 3个tSNP基因型频率分布在健康对照组和COPD患者间的差异进行比较。为分析AQP5基因多态性与COPD严重程度的关系，对轻-中度(轻度+中度)和重度-极重度(重度+极重度)COPD患者AQP5基因多态性的差异进行比较。

1.4统计学处理 采用SPSS 16.0软件进行分析。Hardy-Weinberg平衡及计数资料比较采用χ2检验；计量资料以±s表示，两组间比较采用t检验。采用非条件logistic回归模型计算比数比(odds ratios，OR)及95%可信区间(CI)。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1一般特征 COPD组与对照组的年龄、性别构成差异无统计学意义。COPD组轻-中度(轻度+中度)和重度-极重度(重度+极重度)患者的一般特征比较详见表1。对照组AQP5基因rs3736309、rs296754、rs296759基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(P值分别为0.49、0.75、0.87)；COPD组rs3736309、rs296754、rs296759基因型分布也符合Hardy-Weinberg平衡(P值分别为0.25、0.25、0.38)。除COPD组1例样本的rs296754和rs296759两个位点未分型成功外，其余位点均分型成功。图1、2是3例COPD患者rs3736309的电泳图及测序峰图，显示了3种基因型之间的差异。

2.2AQP5基因多态性与中国北方汉族人群COPD易感性的关系 AQP5 3个tSNP基因型频率分布在健康对照组和COPD患者间的差异无统计学意义(P＞0.05，表2)。

表1 轻-中度与重度-极重度COPD患者一般资料比较Tab.1 Comparison of features between patients with m ild-to-moderate COPD and those with severe-to-very severe COPD

2.3AQP5基因多态性与中国北方汉族人群COPD严重程度的关系 COPD组按严重程度分亚组并与AQP5 tSNP进行关联分析，同时纳入年龄因素调整OR值，发现rs3736309 SNP在轻-中度组与重度-极重度组基因型分布频率和等位基因分布频率中的差异有统计学意义(P＜0.05)。同时rs3736309 tSNP呈共显模式，表现为重度及极重度组高频等位基因纯合子明显减少，低频等位基因纯合子明显增多，杂合子变化频率不大(表3)。

3 讨 论

本研究结果表明，中国北方汉族人群AQP5基因存在明显的基因多态性，根据人类单体型计划数据库公布的中国人AQP5单体型结构，本研究选择的3个tSNP能够代表完整的AQP5基因的单体型结构。本研究采用PCR-RFLP和SNaPshot法进行基因型分析并以抽样直接测序法加以验证，保证了基因分型的准确性。

图1 酶切产物电泳图Fig.1 PCR digested products of rs3736309 separated by 2% Agarose gel

图2 测序峰图与SNP rs3736309的鉴别Fig. 2 Sequence traces and SNP identification of rs3736309

表2 AQP5基因单核苷酸多态性与COPD易感性的关系Tab. 2 Correlation between AQP5 SNP and susceptibility to COPD

表3 AQP5基因多态性与COPD严重程度的关系Tab. 3 Correlation between AQP5 SNP and severity with COPD

既往文献报道，AQP5参与调节黏液高分泌及黏蛋白高表达[6]，且COPD患者气道上皮AQP5表达较对照组降低，可能与气流阻塞的严重程度有关[7]。本研究在基因水平发现AQP5基因多态性与COPD遗传易感性无关，而与COPD患者肺功能损害严重程度相关。rs3736309基因型分布频率和等位基因分布频率与COPD患者气道阻塞程度明显相关，且rs3736309 tSNP呈共显模式，表现为严重组(重度和极重度患者)高频等位基因纯合子(A/A)明显减少，低频等位基因纯合子(G/G)明显增多，提示如果COPD患者基因型为G/G型，可能病情较重，疾病进展迅速。Hansel等[8]通过连续5年随访观察发现，在欧美人群中，AQP5基因多态性(rs3736309、rs296763)与持续吸烟的COPD患者肺功能下降率密切相关，并指出rs3736309的G等位基因与肺功能下降明显相关。但该结果与Ning等[9]的研究结果不同，他们发现中国西北汉族人群的AQP5 rs3736309与COPD患病呈负相关，G等位基因是其保护性因素。

rs3736309位于AQP5第3内含子，虽然内含子不能直接转录编码，但对转录和翻译过程起调控作用，此外，内含子还可参与维护不成熟信使RNA(前基因)的二级结构[10]。因此，rs3736309最终是通过何种机制影响和改变AQP5的功能，还需进一步研究。

既往研究表明，随着年龄增加，肺功能持续下降[11]，吸烟(包括二手烟)是COPD最主要的危险因素之一[12-14]。本研究轻-中度患者与重度-极重度患者中吸烟人数在构成比上差异无统计学意义，因此排除了吸烟作为一个独立因素对疾病的影响。本研究中COPD两个亚组间年龄水平相差显著，轻-中度患者比重度-极重度患者的平均年龄大，这可能与医院收治住院患者的年龄结构有关，将其作为回归分析的矫正因子，发现rs3736309仍与COPD严重程度相关。

COPD作为一种复杂的多基因遗传病，其性状由多种基因多态性共同决定，同时受环境影响，其中每个易感基因可能都是微效基因。针对本研究结果，我们未来将继续扩大样本量，并采用多中心联合研究方式进一步验证。

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Relationship of the aquaporin-5 gene polymorphism with chronic obstructive pulm onary disease in Han population of north China

LIU Kui1, FENG Kai2, WANG Ping1, JIA Hai-ying3, REN Jia-ting1, LU Hao-jun2, PENG Wen-hong1*
1Department of Respiratory Medicine,2Center for Experimental Medicine,3Physical Examination Center, 306 Hospital of PLA,Beijing 100101, China
*

, E-mail: pengwenhong306@yahoo.cn

ObjectiveTo explore the relationship between aquaporin-5 (AQP5) gene polymorphism and the genetic susceptibility and clinical severity of chronic obstructive pulmonary disease (COPD) in Han population of north China. MethodsTwo hundred and twenty COPD patients (142 males and 78 females, aged 37-101 (74.0±10.0) years, diagnosed in the 306 Hospital of PLA from Jun. 2007 to May 2012) were listed as the study group, and 285 healthy subjects (183 males and 102 females, aged 44-97 (72.5±8.6) years) were recruited as control group. The COPD patients with FEV1/FVC ＜70% were divided into 4 subgroups based on Post-Bronchodiflator FEV1: those with FEV1% ≥80% were assigned as m ild subgroup, patients with 50% ≤FEV1% ＜80% as in moderate subgroup, with 30% ≤FEV1% ＜50% as severe subgroup, and those with FEV1% ≤30% as very severe subgroup. Patients in mild and moderate subgroups were combined into mild-to-moderate group, and those in severe and very severe subgroups were combined into severe-to-very severe group. Three tSNPs (rs3736309, rs296754 and rs296759) of AQP5 gene were selected for genotyping by PCR-RFLP and SNaPshot analysis. Chi-square test was used to perform the Hardy-Weinberg test, and unconditional logistic regression was used to calculate the odds ratio (OR) and 95% confidence interval (CI). The genotype frequency distributionwas compared to identify relationship between AQP5 gene polymorphisms and COPD in Han population of north China. The genotype frequency distribution between m ild-to-moderate and severe-to-very severe group was compared tofurther clarify the relationship between AQP5 gene polymorphisms and the severity of COPD.ResultsThe genotype distribution of 3 tSNPs in COPD patients showed no difference from that in healthy controls. Advanced analysis performed in the COPD patients revealed that the genotype distribution of rs3736309 in m ild-to-moderate COPD patients was significantly different to that in severe-tovery severe patients (P＜0.05). The genotypes rs296754 and rs296759 were not associated with severity of airway obstruction.ConclusionThe AQP5 polymorphism is not associated with the incidence of COPD, but associated with a high risk of developing severe of COPD.

pulmonary disease, chronic obstructive; aquaporin 5; polymorphism, single nucleotide

R563.3

A

0577-7402(2013)07-0569-05

2013-03-16；

2013-05-08)

(责任编辑：沈宁)

刘魁，硕士研究生。主要从事呼吸系统疾病的相关研究和治疗

100101 北京 解放军306医院呼吸与重症医学科(刘魁、王萍、任家庭、彭文鸿)，中心实验室(冯凯、路浩军)，体检中心(贾海英)

彭文鸿，E-mail: pengwenhong306@yahoo.cn