抗白粉病小麦近等基因系DNA甲基化的MSAP分析

孙中洁，王振英，潘丽娜

（天津师范大学a.生命科学学院，b.天津市动植物抗性重点实验室天津300387）

小麦白粉病是由禾布氏白粉菌（Blumeria graminis（DC）.Speer f.sp.tritici）引起的一种世界性病害，它直接影响小麦的高产、稳产，是小麦的主要病害之一[1].目前防治小麦白粉病的工作主要集中在两方面，即新抗病基因的发掘和新型抗病品系的选育[2-4]，而对白粉菌胁迫应答的生理机制研究较少，表观遗传修饰尤其是DNA甲基化在白粉病抗性应答中的作用研究更是缺乏.

表观遗传是指在DNA序列不变的情况下，可遗传的基因表达的改变[5-6].可逆的表观遗传修饰能有效避免不必要的基因重组，在调控基因表达的同时维持基因组的稳定性，对于植物的生长、发育、器官分化及其对环境胁迫的适应性具有关键作用[7-9].其中，DNA甲基化是一种最保守的表观遗传修饰，指在DNA甲基转移酶（Dnmt）的作用下，以S-腺苷甲硫氨酸（SAM）为甲基供体，将甲基基团转移到胞嘧啶和鸟嘌呤（CpG）二核苷酸中胞嘧啶的5位碳原子上[5，10].脊椎动物中约有3%～8%基因组DNA的胞嘧啶处于甲基化状态，而在高等植物中约有5%～30%的胞嘧啶是甲基化的[11].DNA甲基化可形成一种封闭的染色质结构，抑制基因转录.对拟南芥全基因组甲基化图谱的分析表明，DNA甲基化在转座子和基因编码区的分布不同，转座子及异染色质区域的基因处于高甲基化状态，约1/3基因的编码区是甲基化的，但它们的启动子区很少发生甲基化修饰[12-14].

本课题组以抗白粉病代换系6A/6V及其与京411的近等基因系（NILs）为实验材料，通过甲基化特异性片段长度的多态性（MSAP）分析其DNA甲基化模式的变化情况，为进一步阐明表观遗传尤其是DNA甲基化修饰在小麦白粉菌胁迫应答中的作用奠定基础.

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

感病品系京411由中国农业大学杨作民教授惠赠；抗白粉病代换系6A/6V由南京农业大学提供；抗病近等基因系NILs是以京411为母本，与6A/6V杂交得F1代，在F1代中选取抗白粉病植株，再以京411为父本，回交7代，再自交1代后获得.

H/M-adapter I接头、H/M-adapter II接头、EcoRI-adapter I接头、EcoRI-adapter II接头、H/M+0引物、EcoRI+A引物、8个H/M+3引物及9个E+3引物均在上海生工生物工程有限公司合成；限制性内切酶HpaⅡ、MspⅠ及EcoR I购自NEB公司；DNA聚合酶、T4连接酶购自宝生物工程（大连）有限公司.

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取

取同一生长时期的0.1～0.2 g小麦叶片，采用CTAB法提取基因组DNA，利用Nanodrop微量紫外分光光度计（Nanodrop科技有限责任公司）和琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取的浓度及质量.

1.2.2 甲基化敏感限制性内切酶酶切与连接

分别采用EcoR I/Hpa II和EcoR I/Msp I酶切基因组DNA，酶切体系如下：EcoR I 5 U，Hpa II（Msp I）5 U，10×Buffer 2.5 μL，基因组 DNA 500 ng，加水至25 μL.上述溶液混匀，37℃水浴酶切2 h后，80℃温浴20 min，使内切酶失活.

接头引物各3 μL，经95℃、5 min变性后，温度递降至室温.按如下体系进行连接：10×T4连接酶Buffer 2 μL，T4连接酶 0.1 μL，E 接头（5 μmol/L）1 μL，H（或 M）接头（50 μmol/L）1 μL，酶切产物5 μL，加水至20 μL.20℃水浴连接过夜，然后65℃温浴20 min，使连接酶失活.

1.2.3 预扩增

反应体系如下：Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.1 μL，dNTP（10 mmol/L）0.4 μL，10×Buffer 2 μL，连接产物 2 μL，E0 引物（50 ng/μL）0.6 μL，M0/H0引物（50 ng/μL）0.6 μL，加水至 20 μL.将上述溶液混匀，采用以下反应程序进行预扩增：94℃预变性2 min，94℃变性30 s，56℃退火1 min，72℃延伸1 min，30个循环后，72℃延伸10 min.利用质量分数为2%的琼脂糖凝胶电泳检测，选取200～1 000 bp呈弥散状分布的产物，根据电泳亮度稀释后进行选择性扩增.

1.2.4 选择性扩增

反应体系如下：Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.1 μL，10 × buffer 2.5 μL，dNTPs（10 mmol/L）0.5 μL，预扩增稀释样品 2 μL，上游引物 1 μL，下游引物1 μL，加水至25 μL.混合上述溶液，采用如下体系进行选择性扩增：94℃预变性2 min，94℃变性30 s，65℃每个循环递降0.7℃，退火30 s，72℃延伸1 min，13个循环，随后56℃退火30 s，72℃延伸1 min，23个循环后，72℃延伸10 min.扩增后，样品中加入7 μL loading buffer（质量分数为98%的去离子甲酰胺；10 mmol/L EDTA，pH8.0；质量分数为0.25%的溴酚蓝；质量分数为0.25%的二甲苯青）.95℃变性5 min，立即置于冰水混合物中准备进行聚丙烯酰胺凝胶电泳.

1.2.5 聚丙烯酰胺电泳及银染显带

采用质量分数为6%的聚丙烯酰胺凝胶，以1×TBE为电泳缓冲液，恒功率65 W，预电泳约30 min，加选择性扩增样品7 μL，待电泳至第1条指示带到达胶板的另一前沿停止，电泳90～120 min分离选择性扩增产物.

电泳后将凝胶放入1 L质量分数为10%的冰乙酸溶液中，轻摇至指示剂无色，约25 min，再用1 L水洗胶板2次，每次5 min.水洗后把胶板放入银染液（1 g AgNO3，1.5 mL质量分数为37%的甲醛，1 L水），轻摇约30 min.用蒸馏水快速水洗胶板5 s后放入1 L预冷的显影液中（30 g无水碳酸钠，1.5 mL质量分数为37%的甲醛，200 μL 10 mg/mL的硫代硫酸钠）中迅速摇动，直至条带出现.最后，用1 L质量分数为10%的冰乙酸溶液终止反应，约5 min后水洗，室温下干燥.

2 结果与分析

2.1 抗病NILs及其亲本京411、抗病亲本6A/6V甲基化水平的变化

为研究DNA甲基化在小麦白粉病抗性应答中的作用，课题组采用MSAP法分析抗病NILs及其感病亲本京411、抗病亲本6A/6V甲基化水平的变化.MSAP方法是参照经典的分子标记——扩增长度多态性法（AFLP）演变而来，因此，其基本原理与AFLP大致相同.不同的是，AFLP法是将基因组DNA用2种限制性内切酶消化，而MSAP法是用一对对甲基化敏感的同裂酶HpaⅡ和MspⅠ代替AFLP法中的一个限制性内切酶对基因组DNA进行消化，之后产生各种长度不一的具有黏性末端的酶切片段，接上人工接头之后，作为PCR扩增模板，利用设计好的不同引物对其进行扩增，得到扩增产物之后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，从而产生扩增片段长度不同的电泳图谱.这对同裂酶HpaⅡ和MspⅠ识别相同的四核苷酸位点5′-CCGG-3′序列，但是对此位点不同甲基化模式的敏感程度不同.HpaⅡ可以切割DNA单链上此位点的外侧或内侧任意一种甲基化模式，却不可切割DNA双链上此位点的外侧或内侧甲基化模式；而MspⅠ可以切割此序列内侧胞嘧啶甲基化模式，无论此DNA是单链还是双链，且不管此序列外侧是否甲基化，只要存在内侧胞嘧啶甲基化，MspⅠ均可将其切割成大小不一的片段[15].

因此，基于这一原理，用MSAP方法分析某DNA序列，经这对同裂酶酶切之后可以产生4种情况（实验中如果出现条带记为“+”，如果没有出现条带记为“－”）：①如果通过HpaⅡ/EcoRⅠ和MspⅠ/EcoRⅠ酶切之后均产生条带，即（++型），表明该序列的5′-CCGG-3′位点未发生甲基化；②如果通过HpaⅡ/EcoRⅠ和MspⅠ/EcoRⅠ酶切之后均未产生条带，即（－－型），表明双链DNA的5′-CCGG-3′位点发生外部甲基化；③如果通过HpaⅡ/EcoRⅠ酶切产生条带，而MspⅠ/EcoRⅠ酶切后没有产生条带，即（+－型），表明该序列发生了单链外侧5′-CCGG-3′位点胞嘧啶的甲基化，即半甲基化；④如果通过HpaⅡ/EcoRⅠ酶切未产生条带，而MspⅠ/EcoRⅠ酶切后产生条带，即（－+型），表明该序列发生了双链内侧5′-CCGG-3′位点胞嘧啶的甲基化，即全甲基化.

如图1所示，本实验利用72对引物组合在NILs、京411与6A/6V基因组DNA HpaⅡ/EcoRⅠ和MspⅠ/EcoRⅠ酶切产物中进行选择性扩增共得到4 601条带，其中NILs、京411与6A/6V中扩增得到条带数分别为4 529条、4 482条和4 518条，3品系共有条带4 411条，NILs与京411共有条带63条，NILs与6A/6V共有条带40条.

图1 近等基因系NILs和亲本京411、6A/6V中MSAP扩增条带数Fig.1 Amount of bands amplified by MSAP in NILs and its parents Jing 411,6A/6V

进一步分析其整体甲基化水平发现，抗病近等基因系NILs整体甲基化水平（22.9%）略低于其感病轮回亲本京411（23.4%），高于其父本6A/6V（21.2%），如表1所示，说明NILs的整体基因表达水平可能高于京411，低于其抗病亲本6A/6V.为排除基因重组对甲基化条带的影响，对3品系共有的4 411条带进行整体甲基化水平分析，发现NILs的甲基化水平（21.1%）仍略低于京411（22.6%），而高于6A/6V（19.8%），如表2所示，说明抗白粉病品系的整体DNA甲基化水平低于感病品系，即相对高水平的基因表达参与了白粉病的抗性应答.

表1 近等基因系NILs和亲本京411，6A/6V中MSAP扩增的条带及甲基化率统计Tab.1 Amount of bands amplified by MSAP and the methylation rate among NILs and its parents Jing411，6A/6V

表2 近等基因系NILs和亲本京411，6A/6V中MSAP扩增的共有条带及甲基化率统计Tab.2 Shared amount of bands amplified by MSAP and the methylation rate among NILs and its parents Jing411，6A/6V

2.2 抗病NILs及其亲本京411甲基化模式的变化

MSAP分析既可在整体上估测全基因组的甲基化水平，也可用于特定位点不同品系基因组的甲基化模式.如图2所示，相对亲本京411，NILs大量位点的甲基化模式发生变异，超甲基化和去甲基化均有发生.根据HpaⅡ/EcoRⅠ和MspⅠ/EcoRⅠ酶切后扩增泳带的差异，可将MSAP扩增位点分为A、B、C、D 4大类、12个亚类，如表3和图2.其中A类NILs与京411的甲基化模式完全相同，即NILs相对京411无甲基化模式的变化.A类又可分3个亚类：A1代表HpaⅡ/EcoRⅠ和MspⅠ/EcoRⅠ酶切后均有条带；A2为HpaⅡ/EcoRⅠ酶切有条带，而MspⅠ/EcoRⅠ酶切后无条带扩增；A3亚类与A2相反，HpaⅡ/EcoRⅠ酶切无条带扩增，而MspⅠ/EcoRⅠ酶切后有条带扩增.B类NILs相对京411的甲基化水平降低，如B1、B2亚类，NILs基因组经HpaⅡ/EcoRⅠ酶切后有条带扩增，而京411无条带，说明该位点京411的DNA序列发生了外侧的完全甲基化修饰；B3亚类中，NILs基因组经MspⅠ/EcoRⅠ酶切后有条带扩增，而京411无条带，说明该位点京411的DNA序列发生了内侧的甲基化修饰；B4亚类中，NILs经2种酶切方式均有条带，而京411无条带，说明该位点发生了甲基化修饰，或者是基因重组位点.C类为NILs相对京411甲基化水平提高的位点，根据酶切扩增条带不同可细分为4个亚类：C1、C4为京411基因组经MspⅠ/EcoRⅠ酶切后有条带扩增，而NILs无条带；C2、C3亚类为京411基因组经HpaⅡ/EcoRⅠ酶切后有条带扩增，NILs无条带.D类为甲基化模式互换条带，NILs经HpaⅡ/EcoRⅠ酶切后有条带扩增，而京411基因组经MspⅠ/EcoRⅠ酶切后有条带扩增，无法判断其甲基化模式提高还是降低.如表3所示，A类条带占绝大多数（96.54%），说明NILs相对京411具有极其相似的遗传背景，基因表达差异不大；B类条带比例（2.89%）明显高于C类（0.55%），即NILs的甲基化水平明显低于京411，通常高甲基化抑制基因表达，说明NILs的整体基因表达水平高于京411.

图2 部分MSAP扩增结果Fig.2 Part of MSAP result

表3 近等基因系NILs与亲本京411的甲基化模式Tab.3 Model of methylation between NILs and its parent Jing411

2.3 抗病NILs及其亲本6A/6V的甲基化模式的变化

根据HpaⅡ/EcoRⅠ和MspⅠ/EcoRⅠ酶切后扩增泳带的差异，也可将NILs相对亲本6A/6V的MSAP扩增位点分为A、B、C、D 4大类、15个亚类，如表4所示.A类占92.52%，是NILs相对亲本6A/6V甲基化模式不变的条带；B类为NILs相对亲本6A/6V甲基化水平降低的条带；C类为NILs相对亲本6A/6V甲基化水平提高的条带；D类为NILs相对亲本6A/6V发生了甲基化模式互换的条带.如表4所示，C类（4.20%）条带明显高于B类（2.96%），说明NILs相对亲本6A/6V甲基化水平明显提高.

综上，抗病NILs相对感病亲本京411的甲基化水平有所降低，而相对抗病亲本6A/6V甲基化水平明显提高，说明NILs的整体基因表达水平高于京411，低于抗病亲本6A/6V，即DNA甲基化水平低.基因表达相对高的品系NILs和6A/6V对白粉病有较强抗性，而整体基因表达相对低的品系京411对白粉病敏感，由此推测，DNA甲基化可能参与小麦白粉病的抗性应答.

表4 近等基因系NILs与亲本6A/6V的甲基化模式Tab.4 Model of methylation between NILs and its parent 6A/6V

3 讨论

植物在生长发育过程中，受到环境因子的多种胁迫刺激，如不适的温度、压力、水肥条件等物理性刺激，以及病虫害等生物胁迫.为了生存与繁衍，生物体必须发展自身的耐受和适应性能，进而推动物种的进化[16-17].胁迫诱导下，植物体需要发生多种代谢反应变化以应对和适应胁迫，其中一种典型的反应就是基因组变异，但通常基因突变、重排是不可逆的，会导致物种的不稳定性.而表观遗传修饰的改变，可在基因序列不变的情况下，引起基因表达的变化[5，18]，并随细胞分裂遗传给子代，如此既赋予生物体耐受胁迫的能力，又不会造成基因的突变、重组，维持了物种的稳定[3-5].小麦白粉病是一种真菌性病害，属于典型的生物胁迫，但目前对表观遗传如DNA甲基化修饰在小麦白粉病胁迫应答中的作用研究较少.

本实验应用MSAP法分析比较抗病近等基因系NILs与其抗病父本6A/6V、感病轮回亲本京411的甲基化差异.由于近等基因系在制备过程中经历了与感病亲本京411的多次回交，NILs的遗传背景与京411极其相似，而且抗病父本代换系6A/6V的V染色体（来自簇毛麦）是独立遗传[19-20]，因此，可认为NILs的基因组DNA除了6V染色体与代换系6A/6V相同，其他染色体与京411相同.NILs与京411对白粉病的抗性不同可能源于6V染色体上的基因，也可能在6V染色体渗入过程中引起整体基因表达的改变.相对于京411，NILs发生DNA甲基化水平降低的条带明显高于甲基化水平提高的条带，且仅B4亚类是NILs独有的扩增条带，可能来自6V染色体，是抗病基因.B1～B3亚类在NILs与京411中均有条带扩增，只是相对来讲，NILs扩增的条带更多，说明外源染色体6V的渗入引起NILs整体基因组DNA甲基化水平降低，其原因可能是6V染色体上.外源抗病基因诱导下游白粉病胁迫应答通路相关基因的DNA甲基化水平降低，基因表达提高，从而对小麦白粉菌侵染产生抗性.

综上所述，NILs与其亲本京411对白粉病抗性不同很可能与它们DNA甲基化水平的差异有关，即表观遗传尤其是DNA甲基化参与了小麦白粉菌的胁迫应答.

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