反义nm23-H1基因对白血病k562细胞株侵袭及增殖的影响

戴振声，徐成兴，黄云胜，徐森华，胡新民

(1复旦大学附属华山医院南汇分院，上海201399;2复旦大学附属上海市浦东医院)

随着对白血病发病机制的深入了解，基因疗法治疗白血病成为研究热点。nm23基因是一种肿瘤转移抑制基因，大量研究证实，其与多种实体肿瘤(如胆囊癌、肝癌、胃癌等)的预后及转移密切相关［1～3］;急性淋巴细胞白血病低分化细胞中 nm23-H1表达量高于相对高分化的细胞［4］。目前关于nm23基因与慢性髓性白血病相关性的研究报道较少。2012年4月～2012年10月，我们观察了抑制慢性髓细胞性白血病细胞株K562细胞nm23-H1基因表达对细胞增殖及侵袭的影响，旨在为分子靶向治疗慢性髓性白血病提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 慢性髓细胞性白血病K562细胞株(上海细胞生物研究所)。试剂:脂质体 Lipofectamin2000(Invitrogen)，G418(Sigma)，TriZol(Invitrogen)，AMV反转录试剂盒(Takara公司);引物由大连Takara公司合成。nm23-H1引物:5'-TrAATCAGATGGTCGGGGAT-3'， 5'-GATCTATGAATGACAGGAGG-3';退火温度:56℃，产物长度:186 bp;β-actin 引物:5'-CCCTGGACTTCGAGCAAGAGAT-3'，5'-GTTTTCTGCGCAAGTTAGG-3';退火温度:54℃，产物长度:531 bp。

1.2 实验方法

1.2.1 nm23-H1 的 RNAi重组体 pGCsinm23(以下简称pGCsinm23)构建及转染 根据GenBank中报道的Nm23-H1基因的核苷酸序列(D1734)，参考siRNA的设计策略，通过基因Blast，挑选长为19个碱基的特异性寡核苷酸序列5'-CAAGTTGGCAGGAACATTA-3'，合成其发卡样两端配对siRNA寡核苷酸链，与用BamHⅠ和HindⅢ双酶切后的pGC载体连接，合成pGCsi nm23。同时合成阴性对照质粒(序列为TTCTCCGAACGTGTCA)。调整K562细胞浓度为2×105个/mL，以每孔2 mL接种于6孔培养板中培养，待细胞增至70%时采用脂质体法行细胞转染，转染8 h后弃去转染液，换含新鲜培养液继续培养1 d，弃去原培养液。转染pGCsi nm23的细胞为观察组，转染对照质粒的细胞为对照组。观察组转染48 h后荧光显微镜下可见细胞核内有绿色荧光，质粒转染效率(=每高倍镜视野荧光细胞数/同一视野下细胞数×100%［3］)约为40%。

1.2.2 观察项目 以下项目观察时间为转染后48 h。

1.2.2.1 nm23-H1 表达 ①nm23-H1 mRNA 表达:采用RT-PCR法测定。分别提取两组细胞总RNA，U-2001型紫外分光光度计定量，均取3 μg total RNA按照试剂盒反应体系逆转录。β-actin作为内参照，nm23-H1基因及β-actin引物序列合成均由大连Takara公司完成，序列见表1。反应条件:预变性95 ℃、5 min，94 ℃、30 s，按表1 温度退火30 s，72℃、40 s共30个循环;72℃延伸4 min。取10 μL产物2%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察nm23-H1基因表达［5］。②nm23-H1蛋白表达:采用Western blot法。分别提取两组细胞总蛋白，细胞数量均为1.0×106。用预冷的PBS洗涤2次，加细胞裂解液在沸水中煮10 min，后离心(20 000 rpm)10 min，取上清10 μL行SDS-PAGE电泳，经硝酸纤维素膜转移，用含5%脱脂奶粉的TBST溶液封闭1 h后，分别与nm23-H1(1∶300)单克隆抗体、β-tubulin多克隆抗体(1∶300)4℃孵育、过夜，β-tubulin为内参照。洗涤后再分别与二抗为HRP标记的牛抗小鼠 IgG(1∶2 500，CA)作用，经ECL底物化学发光显影。

1.2.2.2 细胞克隆形成能力 将两组细胞接种于6孔板上，每孔为1×104个细胞，用含600 μg/mL G418的培养液进行筛选，14 d后甲醛固定细胞，姬姆萨染色20 min，冲洗染色液，观察各平板细胞克隆形成数量。于上层胶中(1.2%低熔点琼脂糖)加入K562单细胞悬液，滴入已铺有下层胶(1.2%低熔点琼脂糖)的24孔板中，每孔加5×103个细胞;培养箱培养2周;倒置显微镜(40×)下观察细胞集落形成数。

1.2.2.3 细胞侵袭能力 采用 0.05%typsin/0.02%EDTA消化后分别收集两组细胞各1×105个，稀释成106/mL;加入100 μL细胞悬液到6-transwell小室的上室中，下室加入600 μL无血清培养液(内含有多种趋化因子);培养24 h后HE染色，轻轻用棉签擦净6-transwell小室上室面无侵袭性的细胞，倒置显微镜(200×)下随机选择5个视野，计数穿过8 μm微孔膜的侵袭性细胞数，取均值。

1.3 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件，采用t检验，P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 nm23-H1表达 两组细胞株内参照β-actin扩增条带亮度几乎一致，但转染组目的条带的亮度较对照组明显减弱(图1)，nm23-H1 mRNA表达水平亦下调(图2)。提示nm23-H1基因被干扰后K562细胞nm23-H1表达水平降低。

2.2 细胞克隆形成能力 转染组及对照组克隆形成数量分别为(12.14 ±3.51)、(4.32 ±0.95)个，转染组明显高于对照组(图3)。两组细胞在软琼脂中生长2周左右即能形成类圆形细胞集落，与对照组比较，转染组集落体积大且形成数量多，见图4。提示nm23-H1基因表达下调后K562细胞软琼脂生长能力明显增强。

图1 K562细胞nm23-H1 mRNA表达

图2 K562细胞nm23-H1 mRNA表达

图3 K562细胞平板克隆形成情况注:A:对照组;B:观察组

图4 K562细胞软琼脂克隆形成情况(40×)注:左:对照组;右:观察组

2.3 细胞侵袭能力 观察组及对照组穿膜细胞数分别为(25.33 ±3.51)、(14.33 ±4.04)个，P ＜0.05(图5)。

图5 K562细胞穿膜情况(200×)

3 讨论

目前，白血病患者在我国的发病率正逐年上升，为2.76/10万。总发病率在肿瘤总发病率中位列第9。慢性髓细胞性白血病(CML)是临床上一种起病及发展相对缓慢的白血病。我国的CML发病率调查结果为年发病率0.36/10万，与亚洲国家相近，低于欧美国家。在我国CML约占各类白血病的20%，占慢性白血病的95%.发病年龄分布较广，但发病率随年龄的增长有逐步上升趋势，男性发病率高于女性。直至今天，CML的治疗方案只能延缓疾病进展。基因治疗白血病近年来研究较多，CML是目前应用反义核酸技术研究最多的白血病。在众多的基因中，nn23基因是近几年来令人关注的基因之一，其表达水平与某些肿瘤的转移和预后相关，被认为是一种肿瘤转移抑制基因。在造血系统，nm23基因与细胞的增殖和分化活动有关，下调nn23-H1基因表达可抑制K562细胞株增殖，降低细胞的恶性程度，对于白血病患者，nm23基因表达可能是预后不良的因素［5］。本研究合成了 pGCsinm23，其转染K562细胞后可有效抑制细胞中nm23-H1 mRNA及蛋白表达水平;转染48 h后K562细胞形成的克隆体积增大，数量增多;且其体外侵袭能力明显增强，提示nm23基因对K562细胞株的生长、增殖及侵袭力有明显影响，与2005年Huang等［6］的研究结果一致，Jung等［7］认为，nm23基因表达与肝癌的侵袭和转移性密切相关，nm23基因表达可抑制肿瘤转移和侵袭的能力。

本研究结果提示，nm23基因是一个与白血病预后密切相关的抑制转移基因。进一步需进行临床患者外周血nm23基因表达与其预后及治疗效果的研究。

［1］Jiang WX，Song BG，Wang PJ.Expression of nm23，KAI1 and spiral computed tomography findings in primary gallbladder carcinoma［J］.Chin Med J(Engl)，2009，122(21):2666-2668.

［2］Boissan M，Wendum D，Arnaud-Dabernat S，et al.Increased lung metastasis in transgenic NM23-Null/SV40 mice with hepatocellular carcinoma［J］.J Natl Cancer Inst，2005，97(11):836-845.

［3］Lee KE，Lee HJ，Kim YH，et al.Prognostic Significance of p53，nm23，PCNA and c-erbB-2 in Gastric Cancer［J］.Jpn J Clin Oncol，2003 ，33(4):173-179.

［4］Magyarosy E，Sebestyén A，Timár J.Expresion of metastasis assaciated proteins，CD44v6 and nm23-H1，in pediatric acute lymphoblastic leukemia［J］.Anticancer Res，2001，21(1B):819-823.

［5］陈宇霞，张美英，熊盛，等.SIRNA分析rim23-H1基因与人慢性髓性白血病的关系［J］.生物工程学报，2006，22(3):403-407.

［6］Huang CS，Shih MK，Chuang CH，et al.Lycopene Inhibits Cell Migration and Invasion and Upregulates Nm23-H1 in a Highly Invasive Hepatocarcinoma，SK-Hep-1 Cells［J］.J Nutr，2005，135(9):2119-2123.

［7］Jung S，Paek YW，Moon KS，et al.Expression of Nm23 in Gliomas and its Effect on Migration and Invasion In Vitro［J］.Anticancer Res，2006，26(1A):249-258.