γ-分泌酶抑制剂对姜黄素后处理心肌保护作用的影响

王 宁，段维勋，杨 阳，李 悦，梁振兴，金振晓，易定华，俞世强

(1第四军医大学西京医院，西安710032;2第四军医大学口腔医学系)

药物干预是对抗心肌缺血/再灌注损伤(IR)的重要策略和主要研究方向。但IR是由多种信号通路和细胞因子参与的复杂过程［1］，由于具体作用机制、药物来源、副作用和伦理学等诸多问题，至今未能获得理想的心肌保护药物［2］。姜黄素(Curcumin，Cur)具有多重心血管保护作用，且毒性作用小、经济、安全，是当前心肌IR研究领域极具研究价值和开发前景的中药［3］。我们前期研究显示，Cur后处理可有效对抗心肌IR损伤，但其机制尚未完全阐明［4］。2012年6～10月，我们观察了 γ-分泌酶抑制剂DAPT(Notch信号通路特异性阻断剂)对Cur后处理心肌保护作用的影响，探讨Notch信号通路在Cur后处理在抗心肌IR中的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 材料 动物:成年SD大鼠40只，雄性，体质量220～250 g，由第四军医大学实验动物中心提供。主要试剂和仪器:DAPT(Santa Cruz公司，美国)，2，3，5-氯三苯四唑(Sigma公司，美国)，LDH检测试剂盒(南京建成公司，中国)。GAPDH小鼠抗大鼠多克隆抗体(中杉金桥生物技术有限公司，北京)，兔抗大鼠Notch1多克隆抗体(Abcom公司，美国)，辣根过氧化物酶标记羊抗兔或鼠IgG(中杉金桥生物技术有限公司，北京)，BCA-100蛋白质定量测定试剂盒(Pierce公司，美国)，组织裂解蛋白提取液(碧云天生物技术公司，上海)，蛋白酶抑制剂(Sigma公司，美国)，预染标准蛋白质Marker(Fermentas公司，美国)。Langendoff离体心肌灌注系统(Radnoti公司，美国)，MP100压力换能器(Biopac Systems公司，美国)，电泳及湿转转移槽(Bio-Rad公司，美国)，Western发光照相系统(Bio-Rad公司，美国)。

1.2 实验方法

1.2.1 离体心脏灌注模型建立及干预 根据文献［4］，Langendoff系统采用经典的 KH 液灌装，KH缓冲液成分(mmol/L):NaCl 118，KCl 4.7，CaCl21.25，MgSO41.2，KH2PO41.2，NaHCO325，葡萄糖5.5。灌流前50 min，以体积分数为95%的 O2和5%的CO2混合气体向储液罐内的灌流液中持续通气，灌流液温度维持在37℃，维持pH 7.35～7.45。SD大鼠腹腔注射戊巴比妥(30 mg/kg)和肝素(500 U/kg)后麻醉，迅速开胸取心脏，立即放入预冷的KH缓冲液(4℃)。将主动脉根部迅速固定于灌注管口，于37℃下用KH液逆行恒压灌注(灌注压为80 mmHg)。心脏复跳后，于左心耳处剪一小口，将带有乳胶水囊的测压管经二尖瓣插入左心室。连接压力换能器，调节水囊使左心室舒张末压至5～10 mmHg，心脏稳定灌注10 min、待心跳稳定后按分组进行灌注。

将40只SD大鼠随机分为对照组、IR组、Cur组、Cur+DAPT组、DAPT组各8只。各组均采用离体心脏Langendoff逆行灌注10 min致心肌缺血，停止灌注30 min后除对照组外其余各组均予KH液再灌注150 min。Cur组再灌注液中含1 μM的Cur，Cur+DAPT 组含有 1 μM 的 Cur 和 0.5 μM 的DAPT，DAPT 组含有0.5 μM 的 DAPT。

1.2.2 观察项目

1.2.2.1 血流动力学指标 采用MP100换能器记录心脏缺血前10 min(以下称为缺血前)及再灌注15、30、45 及 60 min(以下分别以 R15、R30、R45、R60表示)时的心率(HR)、左心室发展压(LVDP)、左心室内压最大变化速率(+dp/dtmax)。收集上述时间点的冠脉流出液，记录冠脉流量(CF)。

1.2.2.2 心肌梗死面积(MI面积) 采用TTC染色法测定。参照文献［4］，心脏处理完毕后于－70℃冷冻10 min，继之沿心脏长轴切成横切面1～2 mm的切片，每个心脏取直径最长的一片。切片在TTC及0.1 mol/L磷酸盐缓冲液中孵育30 min(pH调整至7.4，温度37℃)，再置于40 g/L的甲醛中固定过夜，并行数码摄影。用linageJ1.37软件行图像分析，砖红色区域为正常区域，灰白色区域为梗死区域。MI面积由总坏死区占总切片区的百分比表示。

1.2.2.3 冠脉流出液 LDH 水平 根据文献［4］所述，留取各组R15时的冠脉流出液，LDH检测试剂盒检测流出液LDH水平，严格按照说明书操作。

1.2.2.4 心肌组织Notch1表达 采用Western blot法测定。将留取的心肌组织在裂解缓冲液中匀浆裂解，以12 000 r/min离心15 min。收集组织裂解物，BCA法测定蛋白浓度。取20 μg总蛋白于1×SDS缓冲液中煮7 min，进行SDS-PAGE电泳并电转移至硝酸纤维素膜上。硝酸纤维素膜用含50 g/L脱脂奶粉的TBST室温封闭1.5 h，依次滴加1∶1 000的抗Notch1及GAPDH抗体，4℃过夜后TBST洗涤3次，每次10 min。用1∶5 000的 HRP-羊抗兔或鼠IgG孵育2 h，再用TBST洗涤3次，每次10 min。最后用ECL发光液进行曝光显影，Bio-Rad照相系统进行照相和并用其附带的软件分析蛋白的相对表达量。

1.3 统计学方法 采用SPSS 16.0统计软件行统计学处理，实验结果以¯x±s表示。差异显著性检验采用单因素方差分析，组间差异采用LSD-t法检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血流动力学指标 与IR组比较，DAPT组各时间点LVDP、+dp/dtmax均明显降低(P＜0.01);与对照组比较，DAPT组加药10 min内心率减慢，而LVDP、+dp/dtmax升高(P ＜0.01)，药物去除后，LVDP和+dp/dtmax逐渐恢复到正常水平，各项指标与对照组比较差异无统计学意义。各组缺血前后相关指标比较见表1。

2.2 MI面积 各组MI面积比较见图1。

2.3 冠脉流出液LDH水平 Cur组明显低于IR组(P＜0.01);Cur+DAPT组明显高于 Cur组(P＜0.01);DAPT组与IR组比较无统计学差异，见图2。2.4 心肌组织Notch1蛋白表达 Cur组明显高于IR组(P＜0.01);Cur+DAPT组明显低于Cur组(P＜0.01);DAPT组明显低于 IR 组(P ＜0.01)，见图3。

表1 各组心脏血流动力学指标比较(n=8，¯x±s)

3 讨论

缺血性心脏病治疗的核心是重新恢复心肌血液供应，但缺血心肌组织重新恢复血供(再灌注)后常继发和加重心肌组织损伤，即心肌IR［1］，常导致患者死亡、预后不良、严重并发症发生。心肌IR的病理机制复杂，很多信号通路和细胞因子参与其中［1，11～13］。

研究发现，Notch信号通路在心血管系统发生、发育、病理和生理过程中发挥重要作用［5］，可能在心肌梗死后心肌保护中发挥调控作用［6，7］;Cur可通过Notch信号通路抑制肿瘤细胞增殖并促进肿瘤细胞凋亡［8～10］。药物后处理是对抗心肌IR的有效方法［14，15］。Cur是从 Cur科、Cur属植物的根茎中提取的一种天然有效成分，分子式为C21H20O6，毒性作用小，安全范围大［16］。Cur具有抗氧化、抗感染、抗炎、抗凝、降血脂、抗心力衰竭、抗心肌肥厚及抗动脉粥样硬化等多种心血管效应，且毒性作用小、经济、安全，尤其是其具有明确的抗IR、保护心肌作用极具研究价值和开发前景的中药［17，18］。我们在前期研究中发现，Cur后处理可以有效拮抗心肌IR损伤，但具体机制尚未完全阐明。

图1 各组MI面积比较

图2 各组冠脉流出液中LDH水平比较

图3 各组心肌组织Notch1蛋白表达比较

有报道，心梗后晚期Notch信号通路关键分子NICD(Notch-1分子胞内区)在心梗边缘区(缺血但未坏死，可获得有效再灌注)表达显著上升，即Notch信号通路激活后心功能得到显著改善，提示Notch信号通路激活可能在心肌IR修复中发挥重要调控作用，且与其它信号通路通过复杂的分子网络产生交互作用［19］。本研究得到了相同结果;同时发现激活Notch通路有明确的抗心肌IR作用，其对于抗凋亡相关分子的转录和表达有重要调控作用［20～22］;提示Notch信号通路作为重要物质基础参与了调控心肌的IR过程，激活Notch信号通路具有抗心肌IR作用。本研究发现，Notch通路在心肌急性IR过程中被抑制，而心梗晚期Notch通路活化参与损伤修复过程。进一步证实Notch信号通路可能在心肌梗死后的心肌保护中发挥调控作用［23］。研究显示，Cur可通过Notch信号通路抑制食管肿瘤、口腔肿瘤和胰腺肿瘤细胞增殖并促进肿瘤细胞凋亡［8～10］;因此本实验观察了 DAPT对 Cur后处理心肌保护作用的影响。LDH广泛存在于心肌细胞内，当细胞受损时，细胞内酶释放到细胞外，使血清酶升高，故LDH水平可作为判断心肌损伤程度的一项重要指标［12，19］。本研究结果显示，Cur后处理可改善心脏血流动力学指标，减小MI面积，降低冠脉流出液中LDH释放量。DAPT作为Notch信号通路的特异性阻断剂可消除Cur后处理对心肌IR的保护作用，表现为心脏血流动力学减弱、MI面积增加、冠脉流出液中LDH释放量增加。由此我们推测:Notch信号通路参与介导了Cur后处理抗心肌IR作用，其调控机制有待进一步研究。

本研究为Notch信号通路参与药物后处理心肌保护作用提供了理论依据，有利于寻找全新的药物作用靶点对心肌IR的主要作用环节进行干预，对于获得全新的心肌保护方法提供了新的思路。

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