结核性胸膜炎患者外周血miR-365a-3p、miR-29a-3p的表达及意义

张 帆，刘守江，魏 巍，张国良，陈心春，周伯平，王 健

(1.深圳市南山区慢性病防治中心结核病防治科，广东 深圳 518054；2.深圳市第三人民医院，广东 深圳 518112)

结核性胸膜炎是由结核菌及其代谢产物进入高度过敏状态的机体胸膜腔而引起的胸膜炎症，占结核性疾病的4%，我国胸腔积液患者中超过一半是有结核性胸膜炎引起。结核性胸膜积液如果未能及时诊断与治疗，会造成胸膜肥厚粘连，限制性肺功能下降。结核性胸膜炎的诊断仍是目前临床难题之一，缺乏有效、客观、可靠的方法。近年来的研究表明，微小RNA(microRNA，miRNA)在人体内发挥重要的生物学作用，其是一类高度保守的非编码单链小RNA，近1/3的人类基因表达受miRNA调控，涉及细胞增殖、分化、凋亡等多个过程，miRNA表达异常可导致一些疾病的发生[1-2]。研究显示，miRNA可能参与肺结核病的发生和发展。本研究着重要进一步探讨miRNA在结核性胸膜炎患者中的表达及临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2012年6～11月在我院就诊的结核性胸膜炎患者30例，年龄17～43岁，平均27岁，其中男性16例，女性14例；所有患者根据病史、体征、X线、超声和胸腔积液检查[3]诊断。无脓胸产生，无慢性肺病，无心、肝、肾等脏器合并症及其他感染，无糖尿病、肿瘤等免疫相关性或免疫性疾病；均暂未接受过激素及免疫抑制剂、抗生素及抗结核治疗。同时选取与病例组年龄、性别匹配的30例健康者为对照组。本研究经深圳市南山区慢性病防治院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2 实验方法

1.2.1 样本采集 采集两组研究对象的外周血5 ml，肝素锂抗凝，标本采集后30 min内，分装200 μl全血于已预装有Trizol和研磨珠的冻存管中，振荡器振荡混匀，-80℃保存。

1.2.2 miRNA提取 采用Invitrogen公司Trizol Reagent试剂盒抽提全血中总RNA，适量无RNase水充分溶解总RNA。采用核酸测定仪测定浓度和纯度，琼脂糖凝胶电泳分析RNA完整性良好；调整RNA浓度，于-80℃保存。

1.2.3 逆转录miRNA 取总RNA 1 μl，2×反转录缓冲混合物10 μl，RNase Free水5 μl，反转录酶2 μl，0.1%BSA 2μl。37℃ 60 min，85℃ 5 min，4℃ 5 min。逆转录成cDNA放置-20℃保存备用。

1.2.4 荧光定量PCR 扩增方法参照荧光定量PCR试剂盒(Takara公司)，分别取SYBR Green 12.5 μl，待测样品 cDNA 2 μl，上游引物 1 μl，下游引物 1 μl，水 8.5 μl，总体积25 μl。引物由invitrogen公司合成，引物序列：miR-365a-3p：5'-GCGCTAATGCCCCTAAAAATCCTT-3'；miR-29aL-3p：5'-CGTAGCACCAT CTGAAATCGGTT-3'；下游引物为通用引物；U6：TAKARA公司产品，Code：D356-03，Lot：B101B；。扩增条件：预变性95℃ 10 s；变性和延伸95℃ 5 s；60℃ 20 s，共40个循环。采用荧光定量PCR中的相对定量法，以管家基因U6作为内参，以2-△△Ct表示miRNA相对表达量，具体计算方法如下，待测miRNA的Ct值减去U6的Ct值，获得各样本中待测miRNA的△Ct值，然后采用实验组miRNA的△Ct值减去健康对照组的△Ct，获得△△Ct，最后计算miRNA相对表达量 2-△△Ct。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件进行数据分析，两组间外周血miR-365a-3p和miR-29a-3p的表达差异比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组外周血miR-365a-3p的表达 结核性胸膜炎组患者外周血miR-365a-3p表达(0.66±0.60)明显高于健康对照组(0.33±0.29)，差异有统计学意义(P＜0.05)，见图1。

图1 外周血miR-365a-3p在结核性胸膜炎患者和健康对照组中的表达

2.2 两组外周血miR-29a-3p的表达 结核性胸膜炎组患者外周血miR-29a-3p表达(0.74±0.65)与健康对照组(0.75±0.31)相似，差异无统计学意义(P＞0.05)，见图2。

图2 外周血miR-29a-3p在结核性胸膜炎患者和健康对照组中的表达

3 讨论

结核性胸膜炎发病率高，在肺外结核中仅次于淋巴结核，其确诊主要依赖于痰、胸腔积液、胸膜活检检出结核杆菌或发现结核性肉芽肿，临床上结核性胸膜炎常规检查方法效率低，及时准确地诊断结核性胸腔积液仍存在较多困难。随着新研究新技术的迅速发展，生物学指标在结核性胸膜炎的辅助诊断中起到重要作用，特别是近年来研究发现miRNA分子与一些疾病的发生、发展息息相关。而在我们的研究中发现结核性胸膜炎患者外周血miR-365a-3p表达明显高于健康对照组，miR-29a-3p表达在两组之间差异无统计学意义。

Xu等[4]研究发现miR-365a可能在机体炎症反应中起到重要作用，miR-365a与细胞炎症因子IL-6表达相关，miR-365a可通过直接与IL-6基因的调控区域结合，负性调节IL-6 mRNA表达，从而抑制IL-6蛋白生成，miR-365a还可能通过非直接途径抑制IL-6表达，而且其调控IL-6的能力超过let-7a。在我们的研究中也发现结核性胸膜炎患者外周血miR-365a-3p表达明显升高，其可能参与了结核性胸膜炎炎症反应的发生。

miR-29a除在抗纤维化中起到重要作用外，在机体免疫应答反应中也起到重要作用，miR-29a可通过靶向降解IFN-γ降低机体对胞内病原体的免疫应答，伊正君等[6]研究发现活动性肺结核患者痰液中miR-29a的表达相对于正常人明显升高，可能在抗结核杆菌感染的过程中发挥着重要作用。但在我们的研究中并未发现结核性胸膜炎患者外周血miR-29a的表达与正常人之间的差异，其可能与样本量相对较少有关，具体还需进一步分析。

综上所述，我们的研究发现结核性胸膜炎患者外周血miR-365a-3p表达明显升高，其可能参与了结核性胸膜炎炎症反应的发生，具体作用仍待进一步研究。同时，检测外周血miR-365a-3p水平结合其他诊断方法，可能能提高结核性胸膜炎的诊断率。

[1]Calin GA,Ferracin M,Cimmino A,et al.A MicroRNA signature associated with prognosis and progression in chronic lymphocytic leukemia[J].N Engl J Med,2005,353(17)：1793-801.

[2]孙华麟.miRNA在类风湿关节炎中的研究进展[J].海南医学,2012,23(8)：126-128.

[3]业秀林,郝青林.结核性胸膜炎诊断和治疗进展[J].实用心脑肺血管病杂志,2009,17(1)：75-77.

[4]Xu Z,Xiao SB,Xu P,et al.miR-365,a novel negative regulator of interleukin-6 gene expression,is cooperatively regulated by Sp1 and NF-kappaB[J].J Biol Chem,2011,286(24)：21401-21412.

[5]伊正君,付玉荣,李瑞芳,等.活动性肺结核患者痰液中miR-29a的表达[J].中华微生物学和免疫学杂志,2012,32(4)：333-334.