抗氨甲酰化蛋白抗体的制备及其ELISA检测方法的建立

彭方毅，徐建建，姜海蓉，伍 娟，杨海艳，周 欢

(1.重庆理工大学药学与生物工程学院，重庆 400054;2.重庆市江津区中心医院，重庆 402260)

蛋白质翻译后修饰(post-translational modification，PTM)是指在mRNA被翻译成蛋白质后，对蛋白质上个别氨基酸残基进行共价修饰的过程。随着年龄的增长，人体内积累了许多翻译后修饰的蛋白质。目前报道较多的PTM方法有磷酸化、甲基化、糖基化、糖化、乙酰化、羟基化、泛素化、异构化和脱酰氨基作用，而关于氨甲酰化和瓜氨酸化的报道较少。不同的修饰方式涉及不同的氨基酸残基，存在于不同的疾病生理病理过程中，它们常常伴随多种自身免疫性疾病。

氨甲酰化(carbamylation/homocitrullination)是一种非酶介导的蛋白质翻译后修饰(PTM)方式，其具体过程是蛋白质的赖氨酸(lysine，lys)残基在尿素的衍生物——氰酸酯的作用下转变成高瓜氨酸(homocitrulline，hcit)残基(图1)。此过程存在于尿毒症［1］、肾衰竭(chronic renal failure，CRF)［2－3］、动脉粥样硬化［4－5］和冠状动脉疾病［6］中，可导致一些酶活性的丧失(如MMP2、TIMP-2、insulin)［7－8］。该过程既可以在体内发生，也可以在体外发生［2］。氨甲酰化蛋白已成为一个潜在的疾病生物标志物(biomarker)。

目前，对氨甲酰化蛋白中的Hcit的检测方法主要以液相色谱 －质谱联用法为主［9－11］，这些方法虽然灵敏、准确，但是样品需要经过复杂的前处理，且操作费时，分析成本高，并不适合对大量样品的检测。酶联免疫吸附分析(ELISA)具有简便、快速、灵敏度高、特异性强等优点，已在国内外被广泛应用。针对氨甲酰化蛋白的ELISA分析能追溯到 20 世纪末［1，3，12］，但目前国内外都少见抗氨甲酰化蛋白抗体用于疾病诊断的报道。

图1 氨甲酰化和瓜氨酸化

1 材料和方法

1.1 材料

牛血清白蛋白BSA(北京阿匹斯生物技术有限公司);瓜氨酸 cit(sigma);氰酸钾KCNO(sigma);明胶Gelatin type B(fisher scientific);鸡卵清蛋白OVA、钥孔虫戚血蓝蛋白KLH、弗氏完全佐剂FCA、弗氏不完全佐剂FIA均购自Thermo;羊抗鼠IgG-HRP(thermo);羊抗兔IgG-HRP(北京中杉金桥生物技术有限公司);四甲基联苯胺TMB(thermo);碳二亚胺 EDC(thermo);戊二醛 glutaraldehyde(sigma);BCA蛋白定量分析试剂盒(thermo);anti-citrulline兔多抗Ab6464(Abcam);数据处理软件为GraphPad Prism 5.0;新西兰大白兔由中国科学院遗传与发育生物学研究所动物中心提供并负责饲养;BALB/c小鼠由重庆理工大学药学与生物工程学院实验室喂饲(SPF级)。

1.2 实验方法

1.2.1 免疫原Hcit-BSA的制备

合成方法参照文献［13－14］进行。称取0.0811 g KCNO，溶于10 mL 150 mmol/L的磷酸盐缓冲液中，得到10 mL 0.1mol/L KCO溶液。称取10 mg BSA，溶于10 mL 0.1 mol/L KCNO 溶液。37℃孵育17 h。然后将反应液装入透析袋(MW:8000～14000)，9次换液，透析3 d。透析后离心，弃沉淀，上清液分装保存于－20℃。用BCA法测定蛋白质浓度，SDS-PAGE法鉴定蛋白质纯度。

1.2.2 包被原的制备

Hcit-OVA的制备同Hcit-BSA。

cit-G-OVA:平衡戊二醛至室温;称取5 mg BSA溶于1 mL 20 mmol/L PBS(150 mmol/L NaCl，pH=7.4)中得试剂 A;称取5 mg cit溶于 2.5 mL Milli-Q中得试剂B;加入35μL 25% 戊二醛于试剂A和试剂B的混合液中，4℃反应2 h;加入177μL 0.4mol/L乙醇胺溶液终止反应;室温静置2 h;常规透析，BCA法测定蛋白质浓度，SDSPAGE法鉴定蛋白质纯度。

cit-EDC-OVA:平衡 EDC 至室温;取 500 μL 10 mg/mL OVA溶液为试剂A;称取5 mg cit溶于1.25 mL Milli-Q中得试剂 B;溶解10 mg EDC于1 mL Milli-Q中，取250 μL EDC溶液加入试剂A和试剂B的混合液中;室温反应2 h;常规透析，BCA法测定蛋白质浓度，SDS-PAGE法鉴定蛋白质纯度。

1.2.3 抗体的制备

选用健康、6周龄的雌性BALB/c小鼠6只，健康纯种新西兰白兔2只。小鼠首次免疫和冲击免疫剂量为 60 μg/只，其余均为 30 μg/只。兔子首次免疫和冲击免疫剂量为200 μg/只，其余均为100 μg/只。首次免疫用注射器对抽法将弗氏完全佐剂与免疫原按体积比1∶1混合成油包水乳浊液制成新的免疫原，采用皮下多点免疫。以后换用弗氏不完全佐剂，每隔2周加强免疫1次。从第3次免疫后开始，每次免疫后第7 d采血，离心、收集血清，－20℃冻存。

1.2.4 间接ELISA测定抗体效价

用2 μg/mL的包被原包被 96孔酶标板，100 μL/孔，4℃过夜，洗涤 5次，拍干;加封闭液，200 μL/孔，25℃，2 h，洗涤 5 次，晾干;将抗血清倍比稀释成不同浓度加入酶标板中，100 μL/孔，20℃，振板1 h，洗涤5次，拍干;加酶标二抗(鼠二抗 1∶10 000 稀释，兔二抗 1∶5 000 稀释)，20℃，振板1 h，洗涤 5次，拍干;加入 TMB显色液，50 μL/孔，避光显色 15 min;加入终止液 100 μL/孔;酶标仪读取 OD450－650。

1.2.5 方阵实验

将包被原稀释成 2、1.5、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 2、0.015 6 μg/mL，包被96 孔酶标板，100 μL/孔，4℃ 过夜，洗涤 5 次，拍干;加封闭液，200 μL/孔，25℃ 保持 2 h，洗涤 5 次，晾干;加入一抗，1∶500 开始倍比稀释，100 μL/孔，20℃，振板1 h，洗涤5次，拍干;加酶标二抗(鼠二抗1∶10 000 稀释，兔二抗1∶5 000 稀释)，20℃，振板1 h，洗涤 5 次，拍干;加入 TMB 显色液，50 μL/孔，避光显色15 min;加入终止液100 μL/孔;酶标仪读取 OD450－650。

1.2.6 间接竞争 ELISA(ic-ELISA)鉴定抗体特异性

根据方阵实验的结果包被96孔酶标板，100 μL/孔，4℃过夜，洗涤 5次，拍干;加封闭液，200 μL/孔，25℃保持2 h，洗涤5 次，晾干;加入竞争物 20 μL/孔，抗血清 100 μL/孔，20℃，振板 1 h，洗涤5次，拍干;加酶标二抗(鼠二抗1∶10 000稀释，兔二抗1∶5 000 稀释)，20℃，振板1 h，洗涤5 次，拍干;加入TMB显色液，50 μL/孔，避光显色15 min;加入终止液 100 μL/孔;酶标仪读取 OD450－650。

2 结果与分析

2.1 Hcit-BSA的浓度测定和纯度鉴定

BCA法测得免疫原平均质量体积分数为1116.64 μg/mL(n=4)。SDS-PAGE 结果表明成功合成完全抗原Hcit-BSA(见图2)。

图2 Hcit-BSA的SDS-PAGE结果

2.2 抗血清效价测定

间接ELISA结果表明抗血清只识别Hcit-OVA，不识别cit-G-OVA和cit-EDC-OVA(见图3)。而同样条件下，商品化的 anti-citrulline兔多抗Ab6464(免疫原为cit-G-BSA)只识别cit-G-OVA，不识别Hcit-OVA和cit-EDC-OVA(见图4)。2种抗体均只能识别一种偶联方式的包被原，并未见有交叉反应。在经免疫的小鼠和兔子中，仅19号小鼠才有效价，第5次采血抗血清效价大于1∶8 000(见图 5)。

图3 不同包被原的筛选结果

图4 Anti-citrulline兔多抗Ab6464的特异性鉴定

图5 小鼠效价测定结果

2.3 抗血清方阵实验

方阵实验结果表明抗体最佳稀释倍数为1∶4 000，Hcit-OVA 最佳包被浓度为 0.25 μg/mL(见图6)。

图6 19#B5方阵实验结果

2.4 抗体特异性鉴定

间接竞争ELISA结果表明抗血清特异性识别氨甲酰化产物(carbamylation-derived products，CDPs)，对 Hcit-KLH和 Hcit-BSA优于 Hcit-OVA，与KLH、BSA和OVA均无反应(见图7)。2个结果表明，最低检测限还有待提高。

图7 19#B5间接竞争ELISA结果

3 讨论

合成的 Hcit-BSA具有较强免疫原性，使BALB/c小鼠产生了Anti-CarP。抗体能特异性识别CDPs(如 Hcit-BSA、Hcit-OVA 和 Hcit-KLH)，与cit-G-OVA、cit-EDC-OVA、BSA、OVA 和 KLH 均无反应。而anti-Citrulline兔多抗Ab6464只识别戊二醛偶联方式的 cit(cit-G-OVA)，与 cit-EDCOVA、Hcit-OVA均无反应。2种抗体都只能识别特定偶联方式的包被原，并未见有交叉反应。结果表明所得到的抗血清是氨甲酰化蛋白所特异的，而anti-Citrulline兔多抗Ab6464是cit-G所特异的，而不是cit所特异的。

除了已提到的疾病外，研究者在类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)和预测性关节损伤病人血清中也发现了抗氨甲酰化蛋白的自身抗体。Jing Shi［15］等在超过45%的RA病人血清中检测到抗氨甲酰化抗原IgG类抗体，在超过43%的RA血清中检测到抗氨甲酰化蛋白IgA类抗体。他们研究认为在RA病人血清中的自身抗体除了抗瓜氨酸蛋白抗体(antibodies against citrullinated protein antigens，ACPA)之外，还有 anti-CarP存在，它为RA的检测提供了一个新的可能。同样，Sanna Turunen等［16］用氨甲酰化的蛋白免疫兔子，获得的抗血清既识别含高瓜氨酸的蛋白多肽，也识别含瓜氨酸的蛋白多肽，认为氨甲酰化的蛋白也能引起机体产生抗瓜氨酸化的自身抗体。但是，本研究用了24种含cit的多肽片段对血清和商品化anti-citrulline兔多抗Ab6464进行筛选，均未见明显反应(数据未给出)。因此氨甲酰化与瓜氨酸化之间的关系还有待进一步研究。

针对氨甲酰化与疾病的关系，目前已有一些新发现。Mydel P，Wang Z 和 Brisslert M［17］等评估了氨甲酰化在引发机体免疫应答中的作用，结果表明经氨甲酰化蛋白免疫的小鼠更容易引发关节炎症状，认为赖氨酸的氨甲酰化可能是引发炎症反应的一个重要途径。有研究发现在3H综合症(hyperornithinemia-hyperammonemia-homocitrullinuria syndrome，HHH syndrome)病人中，高瓜氨酸Hcit和鸟氨酸(Ornithine，Orn)可能涉及到神经性损伤［18－19］。在疾病预防方面，Ghaffari M A 和Shanaki M［20］在体外研究了3种维生素对低密度脂蛋白(LDL)氨甲酰化抑制的情况。结果显示维生素C、维生素E和番茄红素都能抑制LDL氨甲酰化，其中番茄红素的抑制作用最强，而维生素能降低尿毒症病人患动脉粥样硬化的风险。随着研究的不断深入，氨甲酰化将逐步受到重视。

本实验采用常规杂交瘤技术有望制备出anti-CarP单克隆抗体，引入生物素－亲和素系统可将最低检测限提高到ng级别及以上，可大大提高检测的灵敏度和特异性。建立了ELISA检测方法，开发出氨甲酰化蛋白检测试剂盒，有助于进一步探究氨甲酰化与瓜氨酸化之间的关系，有可能实现对尿毒症、肾衰竭、动脉粥样硬化等疾病的快速早期检测。

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