一株拮抗绿脓杆菌的抗菌蛋白产生菌的分离与鉴定

余 瑛，汪雅琴，张孝彬，卫泽峰

(重庆理工大学药学与生物工程学院，重庆 400054)

绿脓杆菌(pseudomonas aeruginosa，PA)为人类三大机会致病菌之一，对机体免疫功能低下人群有强致病性。近年来该菌的临床感染率逐年增高，且耐药菌株不断出现，使得感染后的治疗越来越困难。抗菌蛋白(或抗菌肽)是一类普遍存在于生物体内的阳离子多肽，具有抗菌谱广、作用强、起效快、不易产生耐药性等优点［1］，已日益引起广泛关注，成为一类极具开发潜力的新型抗感染制剂。本研究从土壤微生物中筛选出一株拮抗PA的菌株，并对其活性成分进行分离和鉴定，为将来进行新型抗PA药物研发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1)供试菌株。PA标准菌株PA01，由第三军医大学西南医院惠赠。

2)土壤样品。取自第三军医大学西南医院周边土壤。

3)培养基。LB液体培养基:胰蛋白胨10%，酵母膏5%，NaCl 10%，pH值为7.2。发酵培养基:酵母膏3%，胰蛋白胨5%，葡萄糖3%，NaCl 5%，pH值为7.2。抑菌平板培养基:琼脂1%，胰蛋白胨 2.5%，酵母膏 1.3%，NaCl 2.5%，pH 值为7.2。筛选培养基:胰蛋白胨5%，酵母膏2.5%，NaCl 5%，琼脂1%，pH 值为7.2。

4)主要试剂。宽分子量蛋白Marker(TaKa-Ra);柱式小量细菌基因组DNA抽提试剂盒(上海华舜生物技术有限公司生产);16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit(TaKaRa)Sephadex G－100(Rharmacia)。

1.2 方法

1)土壤的采集。采用多点取样法采集医院周边土壤，取回后于4℃保存。

2)拮抗PA的菌株的分离采用双层平板法。取过夜培养的PA01 1 mL与50℃筛选培养基混匀，倒入平板自然冷却，待其凝固即制成下层培养基。将土壤样品充分研磨，静置1 h后取上清。对土壤上清进行梯度稀释，取1 mL与50℃筛选培养基混匀，倒入冷却的下层培养基上，待其自然冷却凝固即制成双层培养基。37℃培养，观察是否有抑菌圈形成。

用灭菌牙签挑取在双层平板上产生透明抑菌圈的菌落，点接到新的双层平板上，37℃培养3 d，观察其是否再次产生抑菌圈。将再次产生抑菌圈的菌株在LB平板上进行划线培养，连续继代3次纯化菌种并保存。

3)拮抗PA的菌株鉴定采用形态学方法和16SrDNA分析法。形态学观察包括对分离菌株在LB平板上的菌落形态观察和革兰氏染色［2］观察。16S rDNA分析方法如下:从平板上挑取分离菌株的单克隆接种于LB液体培养基，37℃，250 r/min过夜培养。次日收集菌体，按照柱式小量细菌基因组DNA抽提试剂盒的说明提取其基因组DNA。以基因组DNA为模板，采用16S rDNA Bacterial I-dentification PCR Kit扩增16S rDNA，扩增产物交上海博尚生物有限公司进行测序。对测序结果进行BLAST和RDB分析。

4)拮抗PA活性的测定参照A.Berger［1］的方法，并做如下改进:在直径100 mm的平板中加入50 mL 50℃左右的抑菌平板培养基，待冷却后，在其上均匀涂布100 μLPA菌悬液。用打孔器在指示平板上打直径9 mm的孔，加入发酵液或目标蛋白，37℃孵育24 h，观察并测量抑菌圈大小。

5)分离菌的发酵培养及拮抗PA抗菌蛋白的分离。挑取分离菌株的单克隆，接种100 mL LB液体培养基，37℃，250 r/min培养24 h。取培养液按体积比1∶100接种发酵培养基，发酵48 h后离心收集上清。用饱和度为30%和60%的硫酸铵分步沉淀发酵上清，弃30%硫酸铵沉淀物。60%的硫酸铵沉淀后，离心收集沉淀。用 pH值为7.4，50 mmol/L的Tris-HCl按体积比1:1溶解沉淀，然后转入Sephadex G－100层析柱进行分离，流速为3 mL/min。用OD280检测，收集各吸收峰的流出液，并测定其抗PA活性。SDS-PAGE电泳［3］测定各吸收峰蛋白质分子量。

6)进行拮抗PA抗菌蛋白的特性分析。①高温耐受性分析:稀释活性峰流出液至50 μg/mL，各取 100 μL，分别于 4℃、37℃、45℃、65℃、100℃处理15 min，测定其抗PA活性。② 蛋白酶K的敏感性分析:稀释活性峰流出液至50 μg/mL，各取 100 μL加入 l mg/mL蛋白酶 K，37℃ 温育30 min，测定其抗PA活性。

2 结果与分析

2.1 拮抗PA的菌株筛选与鉴定结果

采用筛选培养基筛选、分离出菌株 B105。B105在LB固体平板上菌落呈现乳白色，半透明，圆形，中间凸起(见图1(a))。革兰氏染色阴性，菌体长1.2 ×1.0 μm，为短杆菌(见图 1(b))。

图1 B105的形态特征

以提取的各分离菌的基因组DNA为模板，分别采用16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit中的引物 P1、P2和 P1、P3扩增16S rDNA。扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳。结果显示，扩增产物大小与预期大小一致(见图2)，P1、P2扩增产物为500 bp，P1、P3扩增产物为1 500 bp。

图2 16S rDNA扩增结果

16S rDNA扩增产物测序后，经BLAST比对及RDB分析，得出B105与Acinetobacter Iwoffii DSM 2403高度同源，同源性达99%，即 B105属于Acinetobacter(不动杆菌属)。

2.2 B105的发酵培养与拮抗PA活性成分的分离

将B105进行发酵培养后，离心收集发酵液。用饱和度为30%、60%的硫酸铵分步沉淀发酵上清。30%硫酸铵沉淀弃去，60%的硫酸铵沉淀用pH值为7.4的Tris-HC溶解后，采用G100层析柱进行分离，紫外检测显示流出液有2个主吸收峰。采用SDS-PAGE检测得出2个主吸收峰分离出的蛋白相对分子量约为50KD(峰1)和35KD(峰2)(见图3)。抗PA活性测定表明第2个主吸收峰流出液有拮抗PA活性。将第2个吸收峰流出液收集用于高温耐受性和蛋白酶K敏感性分析。

图3 SDS-PAGE电泳测定B105抗菌蛋白的分子量

2.3 B105拮抗PA的活性成分的特性分析

取上述第2个吸收峰流出液稀释液100 μL，分别用4℃、45℃、65℃、100℃处理测定其拮抗PA的活性。抑菌活性测定结果显示，B105产生的抗菌蛋白在经45℃以上高温处理后抑菌环直径变小甚至丧失(见图4)。该结果提示B105产生的抗菌蛋白抗菌活性不稳定，45℃以上高温可破坏其抗PA活性。

取上述第2个吸收峰流出液稀释液100μL，用蛋白酶K处理后进行抑菌活性测定，结果显示其抑菌活性显著降低(见图5)。该结果提示B105拮抗PA的活性成分对蛋白酶K敏感。

图4 B105抗菌蛋白的高温耐受性测定

图5 B105拮抗PA的活性成分的蛋白酶K敏感性测定

3 讨论

PA广泛存在于自然界中，也分布于正常人的皮肤、呼吸道和肠道等与外界相通的腔道中，特别是在呼吸道中定植菌或感染菌最为常见，当机体免疫功能下降时，易发生感染。据文献报告，绿脓杆菌感染主要发生于重症监护室、呼吸科、肿瘤科与老年病科。临床上以肺炎、败血症、腹腔炎症、烧伤、脓毒症、尿路感染最为常见，其中绿脓杆菌肺炎病死率高达30%以上，绿脓杆菌败血症的病死率达80%以上［4］。研究发现PA具有多种针对抗生素的耐药机制［5］，耐药菌株不断增多使得抗PA感染治疗药物日益匮乏，寻找新型抗PA药物已刻不容缓。抗菌蛋白或抗菌肽的抗菌机制与抗生素完全不同，不易产生抗药性，是理想的替代抗生素的新型抗感染药物候选分子。在适当抑菌浓度下，抗菌蛋白或抗菌肽能在体内以直接杀死病原菌的方式起作用，与生物膜组成成分或胞内细胞器等多种微生物靶位相互作用，破坏其完整性，干扰细胞正常代谢活动，导致细菌死亡。抗菌蛋白或抗菌肽同样也可以作为免疫效应分子来启动、调节宿主免疫体系，促进免疫功能，从而消除感染，保护宿主免受病原微生物伤害［6－8］。然而，天然抗菌蛋白或抗菌肽作为药物使用也存在不足，如具有抗菌活性不稳定、进入体内后易被蛋白酶水解等普遍问题。本项目筛选出的不动杆菌产生的抗菌蛋白具有很好的抗PA活性，是进行抗PA药物研发的理想的候选分子，但它在高温或蛋白酶K处理后抗PA活性容易丧失，还需要进行结构修饰、改造等相关研究来增强其抗菌活性的稳定性及提高其抗水解能力，以延长其半衰期。

［1］Berger A，Htran A，Dedier H，et al.Antimicrobial properties of hemokinin－1 against strains of Pseudomonas aeruginosa［J］.Life Sciences，2009，85:700 －703.

［2］周长林.微生物学实验与指导［M］.北京:中国医药科技出版社，2008.

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［8］Vad B，Athomsen L，Bertelsen K，et al.Divorcing folding from function:How acylation affects the membrane-perturbing properties of an antimicrobial peptide［J］.Biochimicaet Biophysica Acta，2010，1804(4):806 －820.