miR-17-5p 在小细胞肺癌中表达升高及与p53 蛋白表达的相关性

王峻 孟丽娟 樊卫飞 蒲骁麟 王琳 许林

小细胞肺癌(SCLC)是一种高度侵袭性疾病，其发生发展与原癌基因的激活和抑癌基因的失活密切相关。miRNAs 是一类最新发现的非编码小分子RNA，主要通过与靶标基因3'UTR 的完全或不完全配对，降解靶基因mRNA 或抑制其翻译，发挥着类似于癌基因或抑癌基因的功能。miR-17-5p 是miR-17-92 簇7 成员之一。p53 是迄今为止最重要的抑癌基因。本文探讨了SCLC 中的miR-17-5p 的表达情况及与p53 蛋白表达的相关性，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 研究对象 66 例SCLC 患者，20 例局限期，46 例广泛期。其中，男45 例，女21 例，年龄43 ～72 岁，平均(55.3 ±4.6)岁。均接受依托泊苷+铂类(EP)方案化疗，4 例局限期患者化疗后接受放疗治疗。所有病例均为淋巴结组织活检标本。

1.2 实验试剂和仪器 石蜡包埋组织总RNA 提取试剂盒(RecoverAllTMTotal Nucleic Acid Isolation Kit，ABI公司);RT 逆转录试剂盒、SYBR-GreenⅠ荧光试剂盒(miRCURY LNATMUniversal RT microRNA PCR，Exiqon公司);hsami-17-5p 引物、内参U6 snRNA 系Exiqon 公司合成;p53 单克隆抗体、EnVision 试剂盒［基因科技(上海)公司］。酶标仪(DU-600 型，Beckman 公司);ABI 7500 Real-time PCR 仪(Ambion 公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 实时荧光定量PCR 法检测miR-17-5p

1.3.1.1 RNA 提取:从66 例存档石蜡组织块中随机抽取25 例形态学正常的癌旁组织。石蜡组织重新切片:≥10 μm 的连续切片。取≤80 μm 的石蜡组织切片，常规脱蜡、蛋白酶消化，按照试剂盒说明书操作步骤提取总RNA;紫外分光光度计检测RNA 溶液A260、A280吸光值，A260/A280比值介于1.8 ～2.0 方可用于cDNA 合成。应用2%琼脂糖变性凝胶电泳检测RNA完整性，RNA 存于－80 ℃备用。

1.3.1.2cDNA 合成:所有模板RNA 浓度调至110 ng/μl，反应体系20 μl:5 ×反应缓冲液4 μl;混合酶2 μl;去核酸酶H2O 10 μl;模板RNA 4 μl;反应条件为:42 ℃作用60 min 后，95 ℃5 min。

1.3.1.3 PCR 扩增:特定加尾结构的hsa-miR-17-5p 引物序列为CAAA GUGC UUAC AGUGCAGG UAG，以第一链cDNA 为模板，反应在ABI 7500 real-time PCR 仪上完成。PCR 扩增体系:cDNA 8 μl，SYBR Green master mix 10 μL，PCR mix 2 μl 共20 μl;反应条件:50 ℃2 min后，95 ℃预变性10 min，随后95 ℃变性15 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，反应40 个循环。

1.3.1.4 Ct 值计算:记录每个反应管中的荧光信号到达所设定的阈值时所经历的循环数即Ct 值，以U6 snRNA 作为内参照，采用定量PCR 中的相对定量法，以2－ΔCt表示肿瘤组织目的基因的表达相对于U6 的变化倍数:△Ct=CtmiR-17-5p-Ctu6。

1.3.2 EnVision 法检测p53 蛋白表达:p53 蛋白表达采用EnVision 法检测。实验步骤按说明书进行。免疫组化判断标准:p53 蛋白以细胞核呈现棕黄色颗粒为阳性，阳性细胞数＞10 为阳性，＜10 为阴性。

1.4 统计学方法 应用统计软件SPSS 20.0 进行数据处理。率的比较釆用卡方检验。相关分析采用列联相关分析法。双侧检验P ＜0.05 认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-17-5p 在SCLC 及癌旁组织中的表达情况实时定量RT-PCR 法检测随机抽取的20 例SCLC 淋巴结组织及相应癌旁组织，结果显示miR-17-5p 在SCLC中的平均表达量为2.81 ±0.38，而在癌旁组织中的表达量为1.07 ±0.58，差异有统计学意义(P ＜0.05)。63.3%(42/66)的患者miR-17-5p 表达升高，其高表达与VALSG 分期及吸烟状态有关(P ＜0.05)，而与年龄及性别无关(P ＞0.05)，见表1。

2.2 p53 蛋白在SCLC 中的表达情况 p53 蛋白在66例SCLC 组织中的阳性表达率为60.6% (40/66)，与临床特征比较，其阳性表达与VALSG 分期及吸烟状态有关(P ＜0.05)，而与年龄及性别无关(P ＞0.05)，见表1。

表1 miR-17-5p 表达及p53 蛋白表达与临床特征的关系(n)

2.3 miR-17-5p 表达与p53 蛋白表达之间的相关性miR-17-5p 表达增高者42 例，其中39 例p53 蛋白表达阳性，经相关性分析显示，二者显著相关(r =0.67，P ＜0.05)。

3 讨论

SCLC 约占肺癌的15%，其发病与吸烟显著相关。根据美国退休军人医院的分期方法(VALSG)，SCLC被分为局限期和广泛期，预后差。若未经治疗，局限期患者预计寿命大约为3.5 月，广泛期大约为6 周［1-2］。

研究显示，miR-17-92 簇失调在肺癌中起重要作用。miR-17-92 簇包含7 成员:miR-17-5p，miR-17-3p，miR-18a，miR-19a，miR-20a，miR-19b-1 和miR-92-1。Hayashita 等［3］发现在肺癌尤其是SCLC 中miR-17-92簇过度表达。Matsubara 等［4］发现应用抗miR-17-5p和miR-20a 反义寡核苷酸抑制miR-17-5p 和miR-20a，可以诱导miR-17-92 簇过度表达细胞的凋亡。同时，Cloonan 等［5］的研究表明在细胞庞大的调控网络中，miR-17-5p 是调节细胞周期G1/S 转化的关键因子。

p53 基因定位于人染色体17p13.1，是与人类肿瘤相关性最高的基因之一，约一半的肿瘤与之相关。p53基因是抑癌基因，是监视基因组的完整性和修复DNA损伤的重要基因［6］。野生型p53 通过点突变转变为突变型p53，随之编码的蛋白失去了肿瘤抑制功能，从而参与肿瘤发病。一般认为用免疫组织化学方法检测到的p53 即为突变型p53 蛋白。多项研究表明p53 蛋白的表达与SCLC 发病密切相关［7-8］。p53 蛋白与SCLC的预后存在争议。一些研究认为p53 突变与预后无关［9-10］;另一些研究认为p53 的表达与化疗效果差相关［11-12］。

在缺氧诱导凋亡的研究中，Yan 等［13］发现在野生型p53 细胞中，缺氧情况下miR-17-92 簇的表达下降;而突变型p53 细胞中，缺氧不能诱导miR-17-92 簇表达的改变。进一步研究显示miR-17-92 启动子近端区域内p53 结合位点调控p53 基因表达。而miR-17-92簇的过表达可显著抑制细胞诱导的凋亡，抑制miR-17-5p 和miR-20a 表达可恢复细胞对缺氧诱导的细胞凋亡的敏感性。本研究发现SCLC 中miR-17-5p 表达升高，显著高于癌旁组织。63.3%的患者miR-17-5p 表达升高，同时，p53 蛋白的阳性表达率为60.6%，相关性分析显示两者显著相关。两者均与VALSG 临床分期及吸烟状态有关，而与年龄及性别无关。提示，miR-17-5p 在SCLC 中表达升高并与p53 蛋白表达的密切相关。但本研究样本量尚小，仍需大样本的研究结果进一步佐证。

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