α-硫辛酸通过激活ERK1/2 减轻葡萄糖/葡萄糖氧化酶所致心肌细胞损伤

张阳阳 姚玉珍 李荣荣 刘莉

高血糖对心肌产生直接损伤，诱导凋亡，是糖尿病心肌损伤的独立危险因素，其机制与产生过多的氧自由基有关［1］，但具体机制未完全明了。大量文献显示，心肌细胞凋亡是糖尿病心肌病发展过程中的关键分子事件［2］。因此，研究高浓度葡萄糖对心肌细胞损伤的机制，以期减少心肌凋亡，延缓糖尿病心肌病及心功能衰竭进程意义重大。

α-硫辛酸(α-lipoic acid，LA)是维生素B 族化合物，能清除自由基，具有抗氧化的作用［3］。临床资料及动物实验均证实，LA 可以安全有效地预防和治疗多种疾病，如糖尿病周围神经病变［4］、多发性硬化症［5］、帕金森病［3，6］、脑梗死等［7］，其机制与凋亡信号通路ASK1/Daxx 抑制［4］、减轻线粒体老化有关［2］。

前期研究发现，LA 可显著减轻高浓度葡萄糖/葡萄糖氧化酶(d-glucose/glucose oxidase，DG/GO)所致的心肌细胞损伤。本研究旨在探讨LA 对DG/GO 所致心肌细胞损伤的分子机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂LA、DG、GO 购自Sigma 公司。DMEM 细胞培养基及胎牛血清(fetal calf serum，FCS)购自Invitrogen Life Technology 公司。细胞培养板、培养皿购自Falcon 公司。

1.2 细胞培养 大鼠心肌细胞株H9c2 来自ATCC，由本实验室保存。培养在含有10% FCS 的DMEM 培养基中。

1.3 ERK1/2 磷酸化水平测定 细胞分组如下:对照组:正常培养;LA 组:培养体系中含有300 μmol/L LA;DG/GO 组:培养体系中含有DG(30 mmol/L)及GO(5 mU/ml)。于LA 或DG/GO 作用3 h 后收集细胞，以Western blot 法检测ERK1/2 磷酸化水平。具体方法为:提取胞浆蛋白，10%SDS-PAGE 电泳，封闭、转膜，一抗4 ℃过夜，加入HRP 标记的二抗4 ℃孵育2 h。显影剂显色后，暗室曝光在X 光胶片上。ERK的活性测定以磷酸化ERK1/2 (p-ERK1/2)与总ERK1/2 的比值表示。实验进行3 次。

1.4 ERK 磷酸化抑制性实验 细胞分组如下:对照组:正常培养;LA 组:培养体系中含有300 μmol/L LA;PD 组:加入ERK 磷酸化特异性抑制剂PD98059(30 μmol/L );PD + LA 组:加 入 PD98059(30 μmol/L)，30 min 后，再加LA。于LA 作用3 h，收集细胞，以Western blot 法检测ERK 磷酸化水平。实验进行4 次。

1.5 细胞存活检测 细胞分组如下:对照组:正常培养;DG/GO 组:用DG(30 mmol/L)及GO(5 mU/ml)刺激细胞;LA +DG/GO 组:用LA(300 μmol/L)预处理细胞，12 h 后加入DG 及GO;PD+LA +DG/GO 组:加入PD98059(30 μmol/L)30 min，然后加入LA，其余同LA+DG/GO 组。

DG/GO 作用24 h 后，收集细胞，按课题组先前报道方法以四唑盐比色法(MTT)测定细胞存活［8］。实验进行5 次。

1.6 细胞凋亡检测 实验分组同“细胞存活检测”。DG/GO 作用24 h 后，按课题组先前报道方法［8］，以Hoechst33342 荧光染色法分析细胞核固缩，以核固缩率作为细胞凋亡的指标。实验进行4 次。

1.7 统计学处理 采用SPSS 17.0 统计软件处理，计量数据均数±标准差(¯x ±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LA 显著激活ERK1/2 如图1 所示，以DG/GO、LA 作用细胞3 h 后，与对照组比较，DG/GO 组和LA组的p-ERK1/2 水平均显著升高(P ＜0.01)。然而，与DG/GO 组比较，LA 组的p-ERK1/2 水平显著升高37.9%(P ＜0.01)。

图1 LA 对ERK1/2 的激活作用

2.2 PD98059 阻断LA 对ERK1/2 的激活作用 如图2 所示，与LA 组比较，PD+LA 组的p-ERK1/2 水平下降了61.4%(P ＜0.01)。与对照组比较，PD +LA 组的p-ERK1/2 水平无显著差异。

图2 PD98059(PD)阻断LA 对ERK1/2 的激活作用

2.3 PD98059 去除LA 对DG/GO 所致细胞存活率下降的保护作用 如图3 所示，与对照组比较，DG/GO 使细胞存活率显著下降了59.5%(P ＜0.01)。与DG/GO组比较，LA +DG/GO 组的存活率显著提高了94.0%(P ＜0.01)。然而，与LA +DG/GO 组比较，PD +LA +DG/GO 组的存活率下降了72.8%(P ＜0.01)。与对照组比较，LA+DG/GO 组的存活率无显著差异。

图3 PD98059(PD)去除LA 对DG/GO所致细胞存活率下降的保护作用

2.4 PD98059 去除LA 对DG/GO 所致细胞凋亡的保护作用 如图4 所示，与对照组比较，DG/GO 使细胞核固缩率增加了74.5 倍(P ＜0.01)。与DG/GO 组比较，LA+DG/GO 组的核固缩率显著下降了90.8%(P ＜0.01)。然而，与LA +DG/GO 组比较，PD +LA +DG/GO 组的核固缩率增加了9.7 倍(P ＜0.01)。与DG/GO比较，PD+LA+DG/GO 组的核固缩率无显著差异。

图4 PD98059(PD)去除LA 对DG/GO所致细胞凋亡的保护作用

3 讨论

长期处于高血糖环境中，易导致糖尿病患者心功能衰竭，糖尿病病情严重程度及心衰程度与血糖控制不佳密切相关［9］，大量体内及体外研究证实，高浓度葡萄糖可直接致心肌凋亡，机制与产生过量的氧自由基有关［1］，因此，很有必要探讨高浓度葡萄糖致心肌损伤的机制。

糖尿病心肌病发生在糖尿病中，心肌细胞肥大，在晚期出现心肌间质及周围血管纤维化，由于心肌细胞再生能力差，心肌细胞凋亡过多造成心功能失代偿［1］。研究报道，高浓度葡萄糖致心肌细胞凋亡，机制涉及线粒体细胞色素c 释放及caspase-3 活化及高糖诱导氧自由基增多有关［1］。

文献报道，LA 是一种抗氧化剂，广泛用来治疗糖尿病及其并发症。LA 通过清除自由基减轻糖尿病神经损伤［4］。LA 通过抗氧化应激对2 型糖尿病大鼠肾脏产生保护性作用［10］。Kowluru［11］报道长期注射LA延缓糖尿病视网膜病变进展，机制是通过抑制视网膜毛细血管细胞的凋亡。Palacka 等［12］发现使用LA 3月能显著性改善糖尿病人心功能，这些数据表明，LA可能通过抗凋亡减轻糖尿病心肌损伤。

本实验发现LA 对DG/GO 所致心肌细胞损伤有保护性作用，且LA 可激活H9c2 心肌细胞ERK1/2。以ERK1/2 选择性抑制剂PD98059 阻断LA 对ERK1/2 的激活作用后，可完全去除LA 对DG/GO 致心肌细胞损伤保护性作用。我们的结果显示，LA 是通过激活ERK1/2 从而减轻DG/GO 所致的心肌损伤的。

ERK1/2 为丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族成员，它能调控各种胞内反应包括新陈代谢、细胞分化、增殖，细胞的存活与凋亡［13］。Ottani 等［14］发现JNK/ERK/SATAT 通路介导，减轻黑质皮素对大鼠冠脉结扎心肌缺血再灌注损伤，减少心梗面积及心肌凋亡。有体外实验报道，丹参酮减少缺氧条件下大鼠H9c2心肌细胞凋亡，该保护作用与ERK1/2 激活相关［15］。Han 等［16］在新生大鼠脑缺血损伤模型中发现脑源性神经生长因子(BDNF)能提高ERK1/2 的磷酸化水平，使用ERK1/2 抑制剂抑制ERK1/2 活性，能消除BDNF对脑缺血的保护作用。Tsao 等［17］报道色素上皮衍生因子(PEDF)激活ERK1/2，减轻H2O2诱导视网膜上皮细胞凋亡，使用ERK1/2 抑制剂PD98059 后，PEDF的保护作用显著减弱。这些数据表明，ERK1/2 对细胞的保护作用可能与参与抗氧化应激来实现。

综上，LA 对DG 引起的心肌细胞损伤有显著保护作用，其机制是通过激活ERK1/2 介导的。除此之外，LA 对糖尿病周围神经病变及糖尿病肾病的保护作用与减少氧自由基有关［4，10］。Wang 等［18］曾报道，LA 促进神经细胞突触生长，机制与增加ERK1/2蛋白磷酸化水平有关，并短暂增加氧自由基含量。使用抗自由基制剂N-乙酰半胱胺酸后，ERK1/2 磷酸化水平下降，并且消除LA 促进神经细胞突触生长。因此，LA 对DG引起的心肌细胞操作保护作用，还可能与氧自由基产生有关。由于适量服用LA 已经被证明对人体是安全的，例如有报道使用LA 治疗2 型糖尿病患者能明显改善糖尿病周围神经病变［19］。因此，进一步探索LA对糖尿病心肌病的预防、治疗作用，很有理论意义和实践价值。

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