青蒿中黄酮、多酚和VC含量测定及抗氧化性研究

（忻州师范学院生化分析技术研究所，山西忻州 034000）

自由基与人的病理、生理有密切关系，大多数自由基氧化性很强，在生理和生物化学中，极少量自由基就可对人身体健康造成很大的损害[1-5]。研究表明，含氧自由基关系到多种疾病，如O2-·自由基可使细胞质和细胞核中的核酸链断裂，会导致肿瘤、炎症、血液病及心肝、肺、皮肤等方面病变的产生；HO·是化学性质最活泼的活性氧物种，能与糖、蛋白质、DNA、碱基磷脂和有机酸等反应，导致身体组织损害和机体退化，引发疲劳、延迟性肌肉酸痛、运动性贫血和血红蛋白尿等，同时也引发皮肤形成色斑、皱纹以及其他皮肤病变。因此，近年来自由基与人体健康关系的研究已经越来越多，成为备受关注的新领域[6-9]。

青蒿（学名黄花蒿）是一年生草本植物，为菊科艾属植物。青蒿叶中含有多种生物活性成分，除抗疟疾特效作用的青蒿素外，还含黄酮、多酚、维生素、氨基酸和各种微量元素[10]。现代科学分析证明：黄酮类化合物有重要的生理活性：能够清除体内自由基、具有抗衰老、治疗心脑血管疾病、降血脂等药用保健功效，是我国古代藏医、蒙医用来治病的常用药；多酚也是青蒿中的重要活性成分之一，有关医学研究报告证实茶多酚具有如下保健治疗效果：护肝养胃、清咽润喉、清除异味、缓解香烟毒害作用；维生素C具有特殊的生物活性和生理特性，如延缓衰老、辅助改善贫血、降压降脂、促进钙质吸收，防止便秘、防癌抗癌。大多数资料是研究干青蒿对自由基清除能力，而本文分别用DPPH·法、水杨酸法和邻苯三酚法对干、鲜青蒿叶总自由基清除能力进行了对比研究，研究结果为保健医学、食品营养学等方面提供了重要的实验参考。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

无水乙醇、95%乙醇（分析纯）：天津市风船化学试剂科技有限公司；过氧化氢（分析纯）：天津市北辰方正试剂厂；12 mol/L的盐酸（分析纯）：郑州市荥阳新华化工厂；硫酸亚铁（分析纯）：江苏金坛县试剂厂；浓硫酸（分析纯）：北京化工厂；抗坏血酸（分析纯）：北京化工厂；邻苯三酚（分析纯）、焦性没食子酸（化学纯）：贵州遵义市第二化工厂；DPPH·（化学纯）：东京化成工业株式会社；槲皮素（生化试剂）：上海恒信化学试剂有限公司；实验用水均为二次蒸馏水。

鲜青蒿叶于2009年7月采集于山西省忻州市。

1.2 仪器

722型光栅可见分光光度计：上海分析仪器总厂；UV-2500紫外可见分光光度计：日本岛津公司；精密电子分析天平（AB204-N）：上海梅特斯-托利多仪器有限公司；数控超声波清洗器（KQ-100DB）：昆山市超声仪器有限公司；电热鼓风干燥箱：天津市三水科学仪器有限公司；真空干燥箱（DZ-1A）：天津泰斯特仪器有限公司；PHS-3tc精密数显酸度计：上海天达仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 超声波法提取鲜青蒿叶中黄酮、VC及多酚

精确称取捣碎的鲜或干青蒿叶3.0 g，加入体积分数50%的乙醇溶液，在37℃水浴中超声提取30min，然后抽滤，将滤液转移到100 mL的容量瓶中，用95%乙醇定容备用。再取上述溶液1 mL于10 mL的比色管中，加入一定体积其他试剂，定容到刻度，测吸光度。

1.3.2 槲皮素-硝酸铝乙醇法[9]测定黄酮及工作曲线

分别吸取 100 μg/mL 槲皮素标准液 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 mL 于 10 mL 比色管中，加入1 mL 5%硝酸铝乙醇溶液，用95%乙醇定容至刻度。摇匀，静置15 min，以蒸馏水做空白，在最大吸收波长428 nm处测吸光度值。以吸光度值A为纵坐标，浓度C（μg/mL）为横坐标绘制标准曲线。求得回归方程为：A=0.059 91C-0.020 12（R2=0.998）。

1.3.3 酒石酸亚铁法测定多酚及工作曲线绘制

分别吸取 1mg/mL 没食子酸 0、0.25、0.50、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75、2.0、2.25、2.5 mL 于 25 mL 比色管中，各补水4.0 mL然后各加入酒石酸亚铁5.0 mL，用缓冲溶液定容至25 mL。摇匀，静置1 h。在最大吸收波长为549 nm处以试剂空白做参比，测其吸光度值；并以吸光度值A为纵坐标,浓度C（μg/mL）为横坐标绘出标准曲线，得回归方程为 A=0.017 35C+0.016 29（R2=0.999）。

1.3.4 硫酸-钼酸铵法测定VC及工作曲线

分别吸取 100 μg/mL VC标准液 1.25、2.5、3.75、5.0、6.25、7.5 mL于25 mL比色管中，每只比色管中各加入2.5 mL 10%硫酸和5.0 mL 10%钼酸铵溶液，用二次水定容至刻度，摇匀，在沸水中煮沸6 min，稍冷却后，在最大吸收波长721 nm处,以试剂空白做参比测其吸光度值，以吸光度值A为纵坐标,浓度C（μg/mL）为横坐标绘出标准曲线，得回归方程为A=0.101 45C+0.174 67（R2=0.996）。

1.3.5 样品中活性物质含量的测定

分别移取一定体积稀释一定倍数的提取液，按照上述实验方法，测其吸光度值，代入回归方程，黄酮、多酚、VC的产率按下式计算：

1.3.6 抗氧化能力的测定[1，6]

1.3.6.1 水扬酸法

清除率的测定：在10 mL比色管中依次加入7.5×10-3moL/L的硫酸亚铁铵 1 mL、再加入1 mL 7.5×10-3moL/L的水杨酸，0.3%的H2O21 mL后，再分别加入提取液 0.5、1、2 mL，反应 20 min后，用二次水定容至10 mL，静置30 min后，用只加硫酸亚铁铵、过氧化氢且定容至10 mL的溶液作参比，静置半小时，测其在510 nm处的吸光度值。

式中：A参比为仅加入 Fe2+、H2O2时的吸光度；A对照为加入Fe2+、H2O2及水杨酸后的羟自由基体系的吸光度；A样参为加入Fe2+、H2O2及不同提取液后的吸光度；A样品为加入Fe2+、H2O2及不同提取液、水杨酸后的羟自由基体系的吸光度。

1.3.6.2 DPPH·法

清除率的测定：分别取提取液2.0 mL及2 mL 2×10-4moL/L的DPPH·溶液加入同一10 mL的比色管中，摇匀，30 min后用试剂空白作参比，测定吸光度A样品，同时用无水乙醇作参比，测定2 mL 2×10-4moL/L DPPH·液与2 mL无水乙醇混合溶液的吸光度A对照，根据下面的公式计算自由基清除率：

式中：A参比为加入无水乙醇时的吸光度值；A对照为加入DPPH·的自由基体系的吸光度值；A样参为加入不同提取液后的吸光度值；A样品为加入不同提取液、DPPH·后自由基体系的吸光度值。

1.3.6.3 邻苯三酚法

抑制率的测定：在4支10 mL比色管中加入2 mL pH=8.43的缓冲溶液，在其中3支比色管中加入0.5、1、2.0 mL的提取液，再往4支分别加入1 mL 0.2×10-3moL/L邻苯三酚，用水定容至刻度，在吸收波长为322 nm处，每隔30 s记录一次吸光度，测量时间4 min，其抑制率计算公式为：

2 结果与讨论

2.1 青蒿叶中黄酮、多酚和VC含量的测定

按照实验方法1.3.2、1.3.3、1.3.4，对比测定了鲜青蒿叶和干青蒿叶中黄酮、多酚和VC的含量，结果见表1。

表1 青蒿中黄酮、多酚、VC的含量Table 1 The flavone，polyphenol and vitamin C content in the fresh leaves of arteminsia annua L. mg/g

由表1可知：鲜青蒿叶中各成分的含量：VC>黄酮>多酚；干青蒿叶中各成分的含量：VC>多酚>黄酮；且干青蒿叶中所含各成分的含量显著高于鲜青蒿叶所含各成分的含量。

2.2 鲜青蒿叶、干青蒿叶提取液的抗氧化能力比较

按实验方法1.3.6.1、1.3.6.2、1.3.6.3分别测定了鲜青蒿叶、干青蒿叶提取液的抗氧化能力，结果见表2、表3。

表2 不同体积鲜青蒿提取液抗氧化性比较Table 2 Comparison of antioxidant capacities of different extraction volume from fresh leaves of Artemisia annua L.

表3 干青蒿提取液抗氧化性比较Table 3 Comparison of antioxidant capacities of different extraction volume from dry leaves of Artemisia annua L.

由表2、表3可知：鲜或干青蒿叶提取液对DPPH·和OH·的清除率及对O2-·的清除率随提取液体积增大，即活性成分黄酮、多酚、VC含量越高，自由基清除能力越强，二者呈一定的量效关系。对比加入相同鲜或干青蒿叶提取液（0.5、1、2 mL）时，干青蒿叶提取液对各种自由基清除率总是高于鲜青蒿叶，差距很大。在相同提取液体积时（如1 mL提取液），不同方法测得的鲜青蒿叶提取液抗氧化能力表现为：OH·的清除率>O2-·的清除率>总自由基清除率（DPPH·法）；干青蒿叶提取液抗氧化能力表现为（如1 mL提取液）：总自由基清除率（DPPH·法）>O2-·的清除率>OH·的清除率；上述结果说明，青蒿叶在贮藏过程中，活性成分有所变化，进而对其抗氧化能力有较大的影响。

青蒿广布于我国全国大部分地区，本文探讨了干鲜青蒿叶中活性成分黄酮、多酚和VC对超氧自由基、羟基自由基和总自由基的清除作用，对寻找天然植物食品抗氧化剂、人体健康所需高效自由基清除剂具有非常重要的价值。青蒿提取物作为天然抗氧化剂，使用安全、具有广阔的应用前景。

[1] 陈金娥,丰慧君,张海容.红茶、绿茶、乌龙茶活性成分抗氧化性研究[J] .食品科学,2009,30(3):62-66

[2] 叶杰,陈躬瑞,倪莉.福建黄酒抗氧化活性的研究[J] .中国食品学报,2006,6(1):345-349

[3] 何战胜,曹朝辉,邓健.甲苯胺蓝光度法测定Fenton反应产生的羟自由基[J] .中国卫生检验杂志,2005,15(2):160-173

[4] 许申鸿,杭瑚.用DPPH·分析法研究野生植物的抗氧化活性[D] .山东:青岛大学学报,1999,12(3):75-78

[5] 韩强,林惠芬,朱玲莉.一些天然提取物对超氧自由基和羟自由基得清除作用[J] .日用化学工业,2000(3):14-17

[6] 赵二劳,张海容,盖青青,等.沙棘黄铜的测定及其抗氧化作用[J] .化学研究与应用,2003,15(2):284-285

[7] 张海容.修饰多糖的抗氧自由基活性及其与DNA结合机理的荧光法研究[D] .广州,华南理工大学,2003：53-60

[8] 陈金娥,高虹.不同品种黄酒中多酚含量及抗氧化性研究[J] .酿酒科技,2008(4):37-41

[9] 赵继红,梁宇,颜达予.黄酮类化合物抗氧化性的结构因素[J] .北京工业大学学报,2001,13(1):36-43

[10] 耿飒,叶和春,李和凤,等.中药青蒿的生理生化特征及其研究发展[J] .应用与环境生物学报,2002,8(1):90-97