钝顶螺旋藻藻蓝蛋白稳定性研究

（中国药科大学生命科学与技术学院，江苏南京 210009）

藻蓝蛋白（phycocyanin，PC）主要存在于蓝藻（Cyanophyta）、红藻（Rhodophyta）、隐藻（Cryptophyta）和少数甲藻（Pyrrophyta）中，是这些藻类进行光合作用的捕光色素之一，在螺旋藻中的含量高达10%～20%[1]。藻蓝蛋白既可以作为天然色素广泛应用于食品、化妆品、染料等工业，同时也具有强烈荧光可制成荧光试剂、荧光探针、荧光示踪物质等，用于临床医学诊断、免疫化学及生物工程等研究领域中。藻蓝蛋白的药理活性非常广泛，具有抗癌、抗氧化、治疗脑缺血损伤、提高机体免疫力等多种生物活性[2]。因此研究藻蓝蛋白的稳定性，尤其是市售藻粉提取的藻蓝蛋白稳定性有重要的生产应用价值。至2012年有关从藻粉中提取藻蓝蛋白的稳定性研究鲜见报道。在保健食品上应用比较多的一般为钝顶螺旋藻，本文比较全面地研究了钝顶螺旋藻藻粉提取的藻蓝蛋白，其溶液和干粉在不同条件下的稳定性，旨在为其开发和应用提供实验参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

钝顶螺旋藻藻粉购自江苏省丹合生物工程有限公司；DEAE-Sepharose FF、羟基磷灰石、硫酸铵、氯化钠、磷酸钾、硝酸钾等均为分析纯。

1.2 仪器与设备

UV1100紫外可见分光光度计：上海美谱达。

1.3 方法

1.3.1 藻蓝蛋白的分离纯化

按照文献[3] 的方法进行。藻粉悬浮于50 mmol/L磷酸盐缓冲中，反复冻融，4℃离心（10 000 g×10 min），上清加入固体硫酸铵至50%饱和度，4℃静置过夜，离心（10 000 g×10 min），收集沉淀，溶解于少量磷酸盐缓冲液（10 mmol/L，pH7.0）中，并在此缓冲液中充分透析，透析液过滤，上样于上述磷酸盐缓冲液平衡的DEAE-Sepharose FF柱，用含0～1 mol/L NaCl梯度的磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，收集蓝色洗脱液，收集的洗脱液透析后，上样于上述同样缓冲液平衡的羟基磷灰石柱，10 mmol/L～300 mmol/L梯度的磷酸盐缓冲液（pH7.0）梯度洗脱，收集A620/A280大于4的蓝色洗脱液，透析后浓缩或冻干即为藻蓝蛋白。

1.3.2 藻蓝蛋白溶液稳定性试验

1.3.2.1 温度稳定性试验

藻蓝蛋白水溶液分别在 4、10、20、30、40、50、60、70℃下避光放置6 h，每隔1 h测定A620。

1.3.2.2 pH稳定性试验

藻蓝蛋白分别溶于pH2.0～9.0的缓冲液中，4℃避光放置，每隔一天测定A620。

1.3.2.3 光照稳定性试验

藻蓝蛋白水溶液分别在 0、500、1 000、2 000、4 000 lx光强下，室温放置72 h测定其A620。

1.3.2.4 NaCl稳定性试验

藻蓝蛋白分别溶于0.5 mol/L～2 mol/L的NaCl时的稳定性溶液中，室温避光放置72 h测定其A620。

1.3.2.5 反复冻融稳定性试验

藻蓝蛋白水溶液在-18℃和室温反复冻融10次，测定其A620。

1.3.3 藻蓝蛋白干粉稳定性试验

1.3.3.1 藻蓝蛋白干粉温度稳定性试验

取适量藻蓝蛋白干粉，平摊于称量瓶中，封口，厚度小于5 mm，置于60℃恒温干燥箱10 d，分别在0、5、10 d时取样，测定其水溶液的A620。

1.3.3.2 藻蓝蛋白干粉光照稳定性试验

取适量藻蓝蛋白干粉，平摊于称量瓶中，封口，厚度小于5 mm，置于25℃，照度4 500 lx条件下10 d，分别在0、5、10 d时取样，测定其水溶液的A620。

1.3.3.3 藻蓝蛋白干粉湿度稳定性试验

取适量藻蓝蛋白干粉，平摊于称量瓶中，封口，厚度小于 5 mm，置于 25℃，相对湿度为（92.5±5）%（饱和KNO3溶液）或（75±5）%（饱和NaCl溶液）条件下，放置10 d，分别在 0、5、10 d 时取样，测定其水溶液的 A620。

2 结果与讨论

2.1 藻蓝蛋白在溶液中的稳定性试验

2.1.1 温度稳定性试验

温度对藻蓝蛋白稳定性的影响，见图1。

注：*P＜0.05，**P＜0.01，与 0 h 相比。

从图1可以看出，藻蓝蛋白在40℃以下较稳定，50℃时，A620下降了12.87%，60℃和70℃时，A620急剧下降。由此可见，藻蓝蛋白不宜在40℃以上的条件下放置。

2.1.2 pH稳定性试验

pH对藻蓝蛋白稳定性的影响，见图2。

从图2可以看出，72 h内，藻蓝蛋白在pH4～8之间较稳定。过酸（pH 2～3）或过碱（pH 9）的条件下均不稳定。

2.1.3 光照稳定性试验

光照对藻蓝蛋白稳定性的影响，见图3。

从图3可以看出，藻蓝蛋白在光照条件下不稳定。500、1 000、2 000、4 000 lx下，光照 72 h 后，藻蓝蛋白的特征吸收峰均明显下降，下降值超过40.11%，黑暗时，72 h后，吸光值也明显下降，下降23.47%。光照条件与黑暗条件下下降比例相比，说明光照会使藻蓝蛋白的稳定性明显下降。由此可见，藻蓝蛋白应在弱光下或最好避光条件下加工及应用。藻蓝蛋白保存时，应避光。

2.1.4 NaCl稳定性试验

NaCl对藻蓝蛋白稳定性的影响，见图4。

从图4可以看出，藻蓝蛋白水溶液放置72 h后，其吸光值下降明显，而在0.5 mol/L～2 mol/L的NaCl溶液中72 h后吸光值下降较小。可见一定浓度的NaCl对藻蓝蛋白有保护作用，但0.5 mol/L与2 mol/L的NaCl对藻蓝蛋白的保护作用差别不大。

2.1.5 反复冻融稳定性试验

反复冻融对藻蓝蛋白稳定性的影响，见图5。

从图5可以看出，反复冻融使藻蓝蛋白的稳定性降低，随冻融次数愈多，活性下降会更明显。因此，和其它蛋白一样，藻蓝蛋白应尽量避免反复冻融。

2.2 藻蓝蛋白干粉稳定性试验

2.2.1 温度稳定性试验

温度对藻蓝蛋白干粉稳定性的影响，见图6（a）。从图6（a）可以看出，藻蓝蛋白干粉在60℃下放置10 d，其稳定性略有下降，说明干粉比其水溶液要稳定得多，但长期保存尽可能在较低的温度下为好。

2.2.2 光照稳定性试验

光照对藻蓝蛋白干粉稳定性的影响，见图6（b）。从图6（b）可以看出，藻蓝蛋白干粉在4 500 lx光强下，随着放置时间的延长，其稳定性有下降的趋势，但比其水溶液要稳定得多，尽管如此，长期保存宜弱光或避光。

2.2.3 湿度稳定性试验

湿度对藻蓝蛋白干粉稳定性的影响，见图7。

从图7（a）和7（b）可以看出，藻蓝蛋白干粉在湿度为（92.5±5）%和（75±5）%的条件下放置 10 d，其水溶液吸光值几乎不变；湿度为（92.5±5）%放置5 d，藻蓝蛋白干粉增重显著，超过5%，而湿度为（75±5）%的条件下放置10 d增重1.8%。由此可见，藻蓝蛋白干粉，在湿度为（92.5±5）%的条件下易潮解。

3 结论

钝顶螺旋藻藻蓝蛋白溶液，在pH处于4～8时，温度低于40℃时比较稳定；光照72 h后，藻蓝蛋白稳定性均有所下降，0.5 mol/L～2 mol/L的NaCl对藻蓝蛋白均有稳定作用，而反复冻融降低藻蓝蛋白活性。干粉状态下的藻蓝蛋白，在温度60℃时，藻蓝蛋白性质有一定改变；在4 500 lx光强下，稳定性明显下降；在湿度为（92.5±5）%时增重显著，在湿度为（75±5）%时增重不显著。因此，长期保存藻蓝蛋白以干粉为宜，在弱光、小于60℃并低湿度环境中保存。

[1] 郝玮.螺旋藻藻蓝蛋白生理活性的研究进展[J] .医学综述，2006,12(2):111-113

[2] 赵艳景,胡虹,王颖.藻蓝蛋白生理活性及作用机制研究进展[J] .安徽农业科学,2011,39(11):6332－6333,6490

[3] 欧瑜,董剑,吴梧桐.盐生隐杆藻藻胆蛋白的分离纯化及特性研究[J] .药物生物技术,2004,11(1):37-41

[4] 国家食品药品监督管理局.中药、天然药物稳定性研究技术指导原则[OL] .北京：国家食品药品监督管理局,2006.http：//www.sda.gov.cn/WS01/CL0844/10637.html