肝组织及血ANXA2 表达异常对肝癌诊断与鉴别的价值

陆少林，张海健，顾 星，时 运，钱 琦，张 洁，王司晔，姚登福

南通大学附属医院临床医学研究中心，江苏 南通 226001

原发性肝癌(primary hepatic carcinoma，PHC)为我国常见的恶性肿瘤，早诊和早治是提高生存率的有效措施［1］。膜联蛋白A2(annexin A2，ANXA2)是膜联蛋白家族成员之一，为钙离子依赖的磷脂酰结合蛋白，在细胞生长、信号转导调控、恶性转变和PHC 发展过程中发挥着重要作用［2］。PHC中ANXA2 表达和Tyr23 残基磷酸化上调［3］，可能是PHC 早期诊断和监测转移血清标志物。然而，ANXA2 在HBV 相关的PHC中的表达特征和诊断价值评估尚未见报道［4］。本文比较了PHC和良性肝病患者的肝组织和血ANXA2 表达水平，探讨了ANXA2 表达对PHC的诊断与鉴别价值。

1 材料与方法

1.1 肝组织的收集 经院伦理委员会批准和患者知情同意，以自身配对法收集PHC 手术切除后癌、距癌灶＞3 cm 癌旁和癌灶＞5 cm 远癌组织各30 份，于液氮中保存;用于制备肝总RNA，分析ANXA2 mRNA 表达;制备蛋白分析肝组织ANXA2 比浓度;用于免疫组织化学染色分析肝组织中ANXA2的表达分布与细胞定位。PHC 诊断依据全国肝癌研究协作组制定的标准核实［5］。

1.2 血清样本 收集115例住院PHC患者血清，男88例，女27例，年龄25～81岁，平均年龄(48.3±11.4)岁;另采集良性肝病患者血清包括慢性肝炎35例、急性肝炎28例、肝硬化38例;所有病例经生化检测、病毒性标志物和超声检查确诊，于清晨采集血液5 ml，分离血清备用;以放射免疫法检测AFP 水平;并以肝炎病毒标志物阴性且ALT 正常的30 份健康献血员血清作对照。

1.3 总RNA 制备及cDNA 合成 用Trizol 试剂(Invitrogen)分离50 mg 肝组织总RNA，琼脂糖电泳分析总RNA 完整性，以Bio-RAD smartspecTMplus 核酸仪检测RNA 浓度和纯度。用cDNA 合成试剂盒(Fermentas)，以1μg 总RNA为模板合成cDNA。

1.4 实时定量PCR 在实时定量PCR 仪(Applied Biosystems)上，反应体系:含25μl 2× SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa，Japan)，2μl 引物混合液(ANXA2 上游，5'-TGAGCGGGATGCTTTGAAC-3'，下 游5'-ATCCTGTCTCTGTGCATTGCTG-3';β-actin 上游5'-ATTGCCGACAGGATGCAGA-3'，下游5'-GAGTACTTGCGCTCAGGAGGA-3');1μl 50×ROX Reference Dye I，4μl cDNA和18μl 双蒸水，于95℃，2 min;95℃，10 s;62℃，1 min;扩增40个循环，根据同时扩增的ANXA2 mRNA和β-actin mRNA的2－△△Ct值变化进行相对定量。

1.5 Western blotting 预冷肝组织于4℃匀浆，800×g 离心10 min，上清液以BCA 法(碧云天生物技术有限公司)测蛋白浓度。取20μg 蛋白经15%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移到聚偏氟乙烯膜，5%牛血清白蛋白4℃封闭过夜，加抗ANXA2和抗βactin(Santa Cruz)－抗孵育4 h，于含有辣根过氧化物酶二抗中孵育1 h，ECL(Millipore，USA)显色，用image J 软件分析蛋白密度，根据蛋白信号强度(SI)，计算ANXA2 相对比值(RR)=SIANXA2/SIβ-actin。

1.6 免疫组织化学染色 以Elivision 一步法免疫组化分析ANXA2 表达。肝组织甲醛固定、乙醇脱水、石蜡包埋、切片3μm、脱蜡，内源性过氧化物酶封闭，高压加热法修复抗原，加ANXA2 抗体、二抗、链霉素抗生物素蛋白－ 过氧化酶、DAB 显色，苏木素复染，透明，封片。Olympus BX50 光学显微镜观察、摄像，以0.01 mol/LPBS(pH 7.5)分别替代一抗、二抗作阴性对照。

1.7 酶联免疫吸附测定 以人ANXA2 ELISA 试剂盒(武汉优尔生科技股份有限公司)检测血ANXA2 浓度，100μl 血清或标准品加96 孔板，加100μl 检测试剂A、B，然后加90μl 底物，最后加50μl 终止液并读取450 nm 处的吸光度。

2 结果

2.1 肝ANXA2 表达的免疫组化分析 自身配对30例肝癌及癌旁、远癌组织中，ANXA2 蛋白表达与细胞定位见图1。ANXA2 表达阳性率，PHC组为100%(30/30)、癌旁组为90%(27/30)、远癌组为0 (0/30)。癌组与癌周组间阳性率未见明显差异(χ2=3.518，P＞0.05)，但组间ANXA2 表达强度，癌组明显高于癌旁组(Z=6.113，P＜0.01)或远癌组(Z=7.328，P＜0.01)。肝组织ANXA2 表达分布存在差异，癌组定位于胞浆和胞膜，癌旁组于胞浆，远癌组中未见表达。

图1 肝癌、癌周及远癌组织ANXA2 表达的免疫组化分析(200×) A:肝癌组织;B:癌周组织;C:远癌组织Fig 1 Immunohistochemistry of hepatic ANXA2 expression and distribution A:HCC tissues;B:Adjacent cancerous tissues;C:Distant cancerous tissues

2.2 肝ANXA2 表达Western blotting 分析 肝癌及自身配对癌旁、远癌组织(n=30)中，ANXA2 蛋白表达的Western blotting 分析结果见图2A，各区带经扫描相对定量，肝组织ANXA2 表达与β-actin的比率见图2B，可见肝癌组ANXA2 表达明显高于癌旁、远癌组(F=498.221，P＜0.001)。

2.3 肝组织ANXA2 mRNA 定量分析 肝癌及自身配对癌旁、远癌组织中ANXA2 mRNA 表达的荧光定量PCR 分析见表1。肝癌组ANXA2 mRNA 过表达，其相对表达CtANXA2与Ctβ-actin值明显高于癌旁组或远癌组(P＜0.001)。

2.4 血ANXA2 水平对肝癌诊断与鉴别价值 肝病患者血ANXA2 表达水平(ng/ml)的比较如图3 所示。PHC组明显高于良性肝病各组(P＜0.001)，肝硬化组(LC)明显高于慢性肝炎组(CH)、急性肝炎组(AH)和正常对照组(NC)(P＜0.001)。肝癌ANXA2表达的病理学特征显示:HBsAg 阳性、伴肝外转移和伴门静脉癌栓组ANXA2的表达，明显高于HBsAg 阴性组(t=6.820，P＜0.001)、不伴肝外转移组(t=3.191，P=0.002)和不伴门静脉癌栓组(t=2.859，P=0.005);肝癌低分化组、中等分化组ANXA 2 表达均显著高于高分化组(P＜0.001);TNM 分期显示，肝癌Ⅲ～Ⅳ期显著高于Ⅰ～Ⅱ期(t=5.594，P＜0.001);另性别、年龄(≥50岁)、肿瘤大小(＞5 cm)和血AFP(＞400 ng/ml)的组间未见明显差异。

图2 肝癌、癌周及远癌组织ANXA2 表达的Western blotting分析 A:Western blotting 分析;B:ANXA2 与β-actin 比率Fig 2 ANXA2 protein level in liver tissue of the patients with hepatocellular carcinoma A:Representative images of western blotting;B:Ratio (ANXA2/β-actin)

表1 肝癌、癌周及远癌组织ANXA2 mRNA 相对定量分析()Tab 1 Relative quantity of hepatic AXNA2 mRNA in hepatocellular carcinoma，adjacent，and distant-cancerous tissues ()

表1 肝癌、癌周及远癌组织ANXA2 mRNA 相对定量分析()Tab 1 Relative quantity of hepatic AXNA2 mRNA in hepatocellular carcinoma，adjacent，and distant-cancerous tissues ()

注:与癌灶组比较，* P＜0.001。

图3 良、恶性肝病患者外周血ANXA2 表达水平检测与比较Fig 3 Comparation of serum ANXA2 levels in the patients with liver diseases

2.5 血ANXA2 与AFP 联合诊断PHC 如以血ANXA2 浓度≥18 ng/ml、AFP≥50 ng/ml为异常，血ANXA2和AFP 表达水平对PHC 诊断价值和联合诊断价值的评估见表2。单一血ANXA2 诊断肝癌的敏感度为87.0%，与AFP 联合诊断肝癌灵敏性增至96.5%，阴性预测值为96.6%。

表2 外周血ANXA2 与/或AFP 诊断PHC的效果比较(%)Tab 2 Eficiency evaluation of serum ANXA2 or/and AFP levels for hepatocellular carcinoma diagnosis (%)

3 讨论

PHC 发生发展是由病毒、化学致癌物等多病因作用，涉及到癌基因或癌相关基因激活、抑癌基因失活及(或)胚胎期某些酶基因重新复活等，经启动、促进、演变多阶段的发病过程，其中与基因调控、生长因子激活等密切相关［2］。PHC 预后很差，因而早期诊断显得极其重要。尽管AFP 是PHC 诊断和监测的有用标志物，但对小肝癌的假阴性率高达40%。最近ANXA2表达上调，可能是PHC 诊断具有应用前景的标志物［6］。本文比较了PHC组织中ANXA2 表达，分析ANXA2 表达病理特征。免疫组化显示ANXA2 在癌组织定位于胞浆和胞膜，癌旁定位于胞浆，远癌组织未见明显表达。癌组织中无论在ANXA2 蛋白或是mRNA水平，均明显高于自身配对的癌旁或远癌组织，提示ANXA2 参与了肝癌的发生发展。

多基因异常参与PHC的形成和多阶段的发展过程，已报道的与诊断相关的标志物众多，但具特异价值的不多，单纯以AFP 诊断肝癌，敏感性和特异性均难以令人满意［7］。随着基因组学、蛋白组学、转录组学、代谢组学等新技术进展和肝癌相关信号通路的阐明，愈来愈多肝细胞恶性转化相关标志物被发现，为肝癌诊断、监测和治疗带来新的契机［8-10］。肝病患者血ANXA2 水平如临界值为≥18 ng/ml，PHC患者阳性率为87%，明显高于肝硬化组(31.6%)和未见过表达的慢性肝炎组、急性肝炎组和正常对照组。AFP为PHC诊断临床常用标记物，在肝硬化、慢性肝炎中均有表达，而ANXA2 除PHC 过表达和部分肝硬化低表达外，其他肝病患者未见表达，表明ANXA2的诊断价值不亚于AFP。

ANXA2 在HBV 或者HCV 相关PHC中表达上调。ANXA2 通过tPA 依赖纤溶酶产生诱导了细胞迁移和血管新生，代表肿瘤转移潜能，促进了PHC 细胞侵袭和迁移。且酪氨酸23 磷酸化依赖的ANXA2 细胞表面定位是侵袭和转移所必须的。PHC组织ANXA2过表达，也可与细胞表面的纤溶酶原和组织纤溶酶原激活物结合，诱导纤溶酶原转变成纤溶酶从而促进肿瘤转移，并导致基质金属蛋白酶的激活和胞外基质成分的降解［11］。PHC患者血ANXA2 表达的病理学特征，显示ANXA2 表达不仅与PHC 侵袭和转移密切相关［12］，还与HBV 感染、肝外转移、门静脉癌栓、分化程度和TNM 分期有关，但与肿瘤大小和AFP 水平间未见明显相关。血ANXA2 或/与AFP对PHC 诊断具有互补诊断效率，表明血ANXA2 检测具较高敏感性、准确性和阴性预测值，联合分析有助于PHC 诊断，也将助于探讨肝癌发病机制，近1/3 肝硬化患者中ANXA2表达处临界状态，是否可作为肝细胞恶性转变的早期标志或是否可成为肝癌基因治疗的靶目标有待研究［13］。

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