上海市普陀区人乳头瘤病毒分型检测及感染情况分析

2013-07-18周宏单咏梅杨凡万海英

分子诊断与治疗杂志 2013年6期

周宏单咏梅杨凡万海英

周宏单咏梅杨凡万海英★

目的探讨上海普陀区妇女宫颈人乳头瘤病毒（HPV）感染亚型及其分布情况。方法采用聚合酶链反应（PCR）体外扩增和反向斑点杂交-基因芯片技术，检测2012年1月至2013年4月连续收集的共659例在本院门诊就诊妇女的宫颈脱落细胞标本。结果 659例临床标本中共检出HPV感染340例，总检出率为51.6%。21种亚型中共检出20种亚型，其中HPV43低危亚型没有检出。感染率居前5位的基因型分别是16型为15.2%、CP8304型为10.2%、6型为8.9%、52型为8.9%、58型为8.4%。单一亚型感染比率为68%，多重感染为32%。20岁以下年龄组、20～29岁、30～39岁、40～49岁、50岁及以上年龄组HPV检出率分别为53.3%，60.7%，48.6%，36.6% 及 57.8%。高危亚型人群中，HPV主要检出亚型为16型、CP8304型、6型、52型及58型。结论 29岁及以下年龄组检出高阳性率说明HPV感染有年轻化的倾向，其中16型、52型、58型等高危型HPV感染是本地区宫颈癌发病的主要原因。

人乳头瘤病毒；基因芯片；宫颈癌

人类乳头状瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）是一种属于乳多空病毒科的乳头瘤空泡病毒A属，是一类特异感染人类的皮肤和粘膜上皮细胞的闭合环状双链DNA病毒（double strand DNA，ds-DNA），具有严格的宿主范围和组织特异性，可以通过多种途径感染生殖道，导致尖锐湿疣以及宫颈病变，甚至可能引起宫颈癌。从高危型HPV的持续感染到一般的宫颈癌前病变并最终发展为宫颈癌大约需要5～10年。因此，有针对性地进行HPV分型检测，对于宫颈癌的早期诊断和治疗具有重要意义。现将2012年1月至2013年4月在本院就诊的 659 例妇女宫颈脱落细胞标本进行HPV分型检测，结果分析如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象

659例临床样本取自2012年1月至2013年4月来本院妇产科或皮肤性病科就诊的、有性生活史、自愿接受下生殖道HPV感染分型筛查的妇女，年龄为15～70岁。

1.2 样本采集

按样本采集操作规程将一次性无菌宫颈细胞采集毛刷深入宫颈外口并顺时针方向旋转4周后，将采样刷和采样柄于刷柄折痕处折断分离，并将采样刷置于细胞保存液中，4℃保存，一周内检测。

1.3 试剂与仪器

1.3.1 试剂

人乳头瘤病毒核酸扩增检测试剂盒（潮州凯普生物化学有限公司）。可同时检测21种亚型。包括15种高危亚型（HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68）和6种低危亚型（HPV6、11、42、43、44，CP8304）。

1.3.2 仪器

ABI5700型基因扩增仪；凯普医用核酸分子快速杂交仪。

1.4 实验方法

1.4.1 样本处理

取500 μL临床标本14 000 rpm离心1 min去上清液，加入400 μL溶液Ⅰ（在45℃水浴中预热）混匀后干式恒温器100℃煮15 min，再加入400 μL溶液Ⅱ，混匀后室温放置2 min，14 000 rpm离心5 min去上清液，室温放置2 min，加入60 μL溶液Ⅲ充分溶解，取1 μL样品做PCR检测。

1.4.2 PCR扩增

反应体系包括Premix 23.25 μL，Taq酶0.75μL，待检上清液1μL，PCR反应总体积为25μL。按试剂盒说明书进行40个循环扩增。

1.4.3 杂交过程

将PCR产物在95℃加热5 min后，立即冰水浴2 min，然后按试剂说明书进行杂交。

1.4.4 结果判断

以HPV基因芯片中两个阳性对照（Biotin对照点和IC内对照点）部位均出现蓝色斑点为实验成功标志。

1.5 统计学分析

实验结果采用χ2检验进行统计学分析，用SPSS13.0统计软件处理不同组别HPV检出率。

2 结果

2.1 HPV感染率及基因型分布

659 例受检妇女中，共检出HPV感染340例，总感染率为51.6%。340例HPV亚型阳性标本检出20种亚型，其中低危亚型43型未检出，HPV-16型为最常见亚型。阳性样本中各亚型的感染率如图1所示。

2.2 HPV感染阳性中高危型及低危型的感染率所占比例情况，如表1。

2.3 HPV感染阳性中单一亚型感染与多重亚型感染的感染率，见表2。

图1 HPV各亚型在阳性样品中的感染率Figure 1 The infection rates of each subtype in HPV positive samples

表1 HPV感染中高危型及低危型的感染率Table 1 The infection rates of high-risk HPV and low-risk HPV

表2 单一感染和多重感染分布比率（n=340）Table 2 The positive rates of single HPV subtype infection and multiple HPV subtype infection (n=340)

2.4 患者年龄分布与HPV阳性率的情况，见表3。

3 讨论

HPV病毒是一种球形DNA病毒，属于乳多空病毒科的乳头瘤空泡病毒A属，能引起人体皮肤黏膜的鳞状上皮增殖[1]。目前已分离出130多种，其中约有20种亚型与人类生殖区皮肤黏膜病变有关。根据其对生殖系统致癌危害性，可将HPV基因型分为高危型和低危型。高危型是宫颈癌的主要发病因素，低危型可以引起良性病变，比如尖锐湿疣等性传播疾病[2～3]。随着子宫颈癌HPV流行病学调查的开展，越来越多的基因型被列为高危亚型。对HPV进行分型在性病病原学和肿瘤学研究方面都有重要意义。

此次受检标本的HPV分型研究发现：（1）上海市普陀区HPV总感染率与北京[4]、辽宁[5]、福州[6]等各地的报道有所差异，其可能原因有：受检人群差异，医务人员掌握的检查指征尺度，或者亚型检测方法不同。（2）上海普陀区HPV感染率居前5位的亚型依次为HPV-16、HPV-CP8304、HPV-6、HPV-52、HPV-58，与刘朝圣[4]，王诗卓[5]，宋艳芳[6]等报道有所差异，说明HPV亚型分布存在一定的地域差异。（3）不同年龄组HPV感染率有差别，组间比较有统计学意义。HPV感染高检出的年龄段为20～29岁和50岁以上年龄组。HPV感染通常通过性行为传播，HPV感染率的高低取决于人群的年龄和性行为的习惯。年轻的、性行为活跃的妇女感染率高，感染的高峰年龄在18～28岁[7]。从我院HPV感染情况分析来看，50岁以上年龄组呈现了高检出率，这个年龄段的高检出率可能与人体的免疫功能相关。（4）多重感染以同时感染两个基因型为多见，同一样本最多检出7种亚型，多重感染增加了癌前病变的风险。

本次HPV分型筛查结果的分析，对于上海市HPV感染亚型分布情况的研究有重要的参考价值，对以后疫苗的研制和宫颈疾病的治疗有重要的意义。

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Analysis of human papillomavirus genotype and infection in Putuo District of Shanghai

ZHOU Hong, SHAN Yongmei, YANG Fan, WAN Haiying★
(The Laboratory Medicine of Tongji Hospital Affiliated to Tongji University, Shanghai 200065, China)

Objective To investigate the human papillomavirus (HPV) infection subtype in females and its distribution in Putuo District, Shanghai. Methods Polymerase chain reaction (PCR) and reverse dot blot hybridization and DNA microarray technology were used to detect 659 cases of cervical cytology specimens that collected from January 2012 to April 2013. Results There were 340 cases of positive HPV in 659 samples, and the detection rate was 51.6%. 20 kinds of subtypes were detected in 21 kinds of known subtypes. The low-risk type HPV-43 had not been detected. The infection rate of the top five genetypes were HPV-16 (15.2%), HPV-CP8304 (10.2%), HPV-6 (8.9%), HPV-52 (8.9%), HPV-58 (8.4%), respectively. Single HPV subtype infection rate was 68%, and multiple HPV subtype infection rate was 32%. The HPV detection rates in different age groups (＜20, 20～29, 30～39, 40～49, ≥50) were 53.3%, 60.7%, 48.6%, 36.6% and 57.8%, respectively. In high-risk groups, the main HPV subtypes were HPV-16, HPV-CP8304, HPV-6, HPV-52 and HPV-58. Conclusion The high positive rate in age groups of ＜20 and 20～29 illustrated that the HPV infection tend to younger. The high-risk type HPV-16, HPV-52 and HPV-58 played a major role in cervical cancer occurrence and development in local area.

HPV; Gene chip; Cervical cancer