生活方式干预与细胞免疫功能的相关性研究

石婷婷曾丽英★莫芸罗旋景尉钟惠珠何桂儿

生活方式干预与细胞免疫功能的相关性研究

石婷婷1曾丽英1★莫芸2罗旋1景尉1钟惠珠3何桂儿4

目的 探讨健康生活模式对机体自然清除HPV病毒的价值。 方法 对HPV感染者随机分为干预生活方式实验组和对照组，分别对实验组和对照组进行宫颈分泌物T淋巴细胞及其亚群（CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+）定量检测，半年后复查宫颈HPV病毒和宫颈分泌物T淋巴细胞及其亚群定量检测。结果 实验组的HPV病毒清除显著高于对照组（P＜0.01）；实验组和对照组在干预治疗前CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+组间均无显著性差异；实验组干预治疗后CD3+、CD4+、CD4+/CD8+较实验前显著升高（P＜0.01），而CD8+显著下降（P＜0.01）；对照组在实验前后CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+均无显著性差异（P＞0.05）。 结论 对HPV感染者进行生活方式干预治疗，有助于患者免疫能力的改善和病毒的清除，降低宫颈癌病变和宫颈癌的发生。

HPV感染；自然清除；T淋巴细胞

众所周知，宫颈癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁女性身体的健康和生命，据统计每年有近50万新发病例，而总体5年生存率在5%左右[1]。已有研究证明99%的宫颈癌组织中可检出人类乳头状病毒（Human Papillomavirus, HPV），HPV感染尤其是高危型HPV持续性感染是宫颈癌前病变和宫颈癌发生的必要条件；女性一生中曾HPV感染高达80%[2]。虽然大多数HPV感染者能在一定的时间内把体内的病毒自然清除掉，但是有少数的患者持续感染最终演变成宫颈癌前病变和宫颈癌，所以也可以说宫颈癌是一种感染性疾病，但由于病毒的变异及其本身的特殊结构，使目前对HPV的感染尚无特殊有效的药物治疗，必须依靠机体天然的免疫力去清除体内的病毒。在正常情况下，当机体遭受病原体入侵以后，必然产生免疫应答，即产生细胞毒性T淋巴细胞及分泌抗体B淋巴细胞，以阻止感染和清除被感染的细胞。大量的临床经验证明，相同的感染条件下，机体免疫力的强弱决定着疾病的转归。本研究组拟对HPV感染者的生活方式进行干预，以探讨干预治疗方式对改善机体的免疫抵抗力，提高宫颈分泌物中T淋巴细胞的含量而使机体具有清除HPV的临床价值，从而阻断宫颈癌前病变和宫颈癌的发生。

1 资料与方法

1.1 一般资料

随机选择2010年9月～2012年9月我院妇科门诊普查发现的HPV阳性感染者258例，并排除自身免疫性疾病、其他生殖道病毒感染、肿瘤、糖尿病及结核等可能影响机体免疫力的疾病，所有患者就诊前均未接受任何针对该病的物理及化学药物治疗，按就诊日期随机分组，其中生活方式干预实验组158例，非干预对照组100例。生活方式干预：（1）每周至少有氧运动4次，每次半小时以上；（2）每天安安静静听自己喜欢的音乐半小时以上；（3）按时睡眠，每天23:00之前进入睡眠；（4）不吸烟，不酗酒；（5）如果不能按要求做到的患者，退出实验组；（6）利用先进的通讯工具，每半个月温馨提醒一次实验者严格按照质量完成生活方式干预的措施。

1.2 方法

所有HPV阳性的患者均用无菌拭子采集宫颈分泌物置于无菌试管中，获得宫颈脱落细胞，进行宫颈分泌物T淋巴细胞及其亚群检测，然后随机进入实验组或对照组。半年后所有患者均复查宫颈分泌物HPV病毒和T淋巴细胞及其亚群检测。

1.2.1 T淋巴细胞及其亚群检测

本研究中T淋巴细胞及其亚群采用流式细胞术，选用美国BD公司BD FACSCalibur流式细胞仪及其配套试剂检测。操作方法：（1）取流式细胞仪专用的12 mm×75 mm试管（Falcon管），按标本顺序编号。（2）给试管里面加入2 mL PBS，将分泌物拭子在PBS里面来回混荡，尽量将拭子上的细胞混散在PBS里面，弄完后200 g离心力离心5 min，倒掉上清液。（3）给试管里面加入10 μL 抗体，混匀避光孵育30 min，时间到后加入2 mL PBS，200 g离心力离心5 min，倒掉上清液，然后加入450 μL的1%多聚甲醛固定液，即可上机检测，如不能及时检测，可放4℃冰箱24 h内上机检测。

1.2.2 HPV DNA荧光定量PCR

采用的是实时荧光定量PCR技术，选用仪器为Applied Biosystems公司的7500 Real-Time system，试剂由中山大学达安基因股份有限公司提供。所使用引物为：正向引物5'-GTTATCGCCTCCCCCAAAT-3'，反向引物5'-ATCTGGCTTTTCCTTTTCAGG-3'。操作方法：（1）标本处理：将粘有分泌物的棉拭子置于1 mL生理盐水中充分震荡摇匀，挤干棉拭子中的水分，弃棉拭子，转移液体至离心管中，12 000 rpm离心5 min，弃尽上清，重复洗涤一次后，在沉淀中加入50μL DNA提取液，充分混匀，100℃沸水浴10 min， 10 000 rpm离心5 min，取上清2 μL做PCR反应。（2）PCR反应：按比例取相应量的PCR反应液及Taq酶，充分混匀后按43 μL/管分装至0.2 mL离心管中备用。取准备好的试剂于0.2 mL离心管中，加入处理后的样品上清液2 μL，8 000 rpm离心数秒按下列条件扩增：93℃ 2 min预变性，然后按93℃ 45 s→55℃60 s做10个循环，93℃ 30 s→55℃ 45 s做30个循环。（3）Real-Time system检测分析：设置好分析条件，在Analysis菜单下选择Analyze自动分析结果。

1.2.3 统计学方法

采用 SPSS 16.0 统计软件，实验组与对照组间、治疗前后比较采用配对t检验，两组间比较采用成组t检验。

2 结果

2.1 宫颈分泌物中T淋巴细胞及其亚群的结果

通过流式细胞分析仪对宫颈分泌物中的淋巴细胞含量及其亚群进行分析，可由检测系统直接计算得到。本研究采用的检测系统结果显示见图1，提示该样本的T淋巴细胞Gate值为15%，在总细胞比例为15%。其中CD3+的Gate值为23.72%，CD3+CD8+的Gate值为10.7%，CD3+CD4+的Gate值11.63%。

2.2 宫颈分泌物中HPV病毒定量检测结果曲线图

HPV病毒定量的结果判定主要依据增长曲线和CT值，当增长曲线不成S型或CT值为30，HPV病毒含量低于检测范围，视为阴性。反之当增长曲线成S型或CT值小于30，HPV病毒视为阳性。检测系统结果显示见图2，该标本的增长曲线为S型，CT值约为15，提示为强阳性结果。

2.3 实验前后宫颈分泌物中CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+含量情况

实验组和对照组在生活方式干预治疗前CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+组间均无显著性差异；实验组干预治疗后CD3+、CD4+、CD4+/CD8+较实验前显著升高（P＜0.01），而CD8+则显著下降（P＜0.01）；对照组在实验前后CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+均无显著性差异（P＞0.05），见表1。

2.4 实验组和对照组HPV感染转阴性情况

图1 T淋巴细胞及其亚群检测结果Figure 1 The test results of T lymphocytes and its subtypes

实验组的HPV患者转阴比例46.2%显著高于对照组的27.0%，表明实验组的HPV病毒清除率显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01），见表 2。在治疗前，实验组与对照组在数量和比例上无显著性差异，提示宫颈局部的免疫功能相当。在实验前后，对照组T淋巴细胞及其亚群在数量和比例上基本保持不变，尤其是CD4+、CD8+T淋巴细胞无显著性差异，表明宫颈局部的免疫功能并无改变。经过生活方式干预疗法之后，实验组T淋巴细胞的含量有显著性改变，发挥抗肿瘤作用的CD4+含量显著性增加，抑制机体抗肿瘤作用的CD8+含量显著性降低，两者的比例显著性升高，表明宫颈组织局部免疫力得到增强。这个结果也充分印证了表2数据出现的必然性。通过对实验结果的分析，可以得知健康的生活模式确实能够提高宫颈组织局部免疫力。

3 讨论

当HPV病毒入侵机体时，机体会及时启动自身免疫系统，而T淋巴细胞在机体免疫系统内发挥着中心调控作用，是机体免疫的重要效应细胞[3～4]，它所介导的细胞免疫反应在杀伤肿瘤细胞、控制肿瘤生长中起重要作用[5]。当机体免疫系统与病毒抗争失败时，T淋巴细胞及其亚群的数量、功能会发生改变，从而导致 HPV持续性感染乃至诱导宫颈癌的发生和发展。

图2 宫颈分泌物中HPV病毒定量检测结果曲线图Figure 2 Graph of quantitative determination with HPV in cervical secretions

表2 实验组和对照组HPV感染转阴性情况比较Table 2 Compared of the HPV negative infection in intervention group and control group

表1 实验组和对照组实验前后宫颈分泌物中CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+的变化Table 1 Change in cervical secretions of CD3+, CD4+, CD8+, CD4+/CD8+in intervention group and control group before and after experiment

T淋巴细胞在胸腺发育过程中，产生了 CD4+和CD8+两大亚群[6]。两大亚群在抗肿瘤反应中作用各不相同，但相互协调、相互制约，共同参与对机体免疫应答的调节作用，反映了机体抗肿瘤免疫状态的总体水平[7]。有研究表明，T 淋巴细胞亚群状态异常和比例失调的现象，在混合多种肿瘤患者中较为明显[8～10]。与正常人相比，宫颈癌患者 T淋巴细胞中CD4+细胞减少、CD8+细胞升高，CD4+/CD8+降低。Passmore等[11]研究证实，宫颈处和血液中的CD4+细胞和CD8+细胞对 HPV16 E7抗原的反应强度相似，且有明显相关性。在宫颈癌及其癌前病变的肿瘤微环境中，CD4+细胞逐渐减少，辅助细胞免疫及体液免疫的作用受到影响，T细胞各亚群之间平衡紊乱，抑制了机体的抗肿瘤免疫，上述情况破坏了宫颈组织局部免疫微环境的平衡，最终导致宫颈病变，也有利于肿瘤的进展、侵袭或转移。所以，在宫颈癌研究中，研究人员需要关注宫颈局部的免疫功能改变，并分析其对疾病转归的影响。在本研究中，实验组进行生活方式干预后宫颈分泌物CD3+、CD4+水平升高：CD3+T（总T细胞淋巴细胞）、CD4+T（辅助性T细胞/Th）升高，细胞免疫应答增强；CD8+水平下降：CD8+T（细胞毒性T细胞/Tc和抑制性T细胞/Ts）下降，免疫抑制作用减弱，提示机体局部免疫作用增强，有利于对HPV病毒的自然清除。故我们对所有的患者均进行了HPV病毒的检测，实验结果也表明，实验组的HPV清除率显著高于对照组。从这两个不同方面的检测结果来看，它们之间也是相互印证的，更有力的支持实验组宫颈局部的免疫力得到增强的这个结论。综上所述，增强宫颈局部的免疫功能就能提高人体对HPV病毒的自然清除。

本研究试行的生活方式从运动、心境、睡眠等几个方面来改善生活质量，提倡进行适宜的运动、动静结合、充足的睡眠和轻松愉快的音乐环境等，这些措施是希望可以使人在疲劳中恢复过来，使受损的细胞恢复，从而发挥其免疫功能，提示我们良好的生活方式有助于全面提高人体的免疫力，增强对各种致病因素的清除。而由于目前国内外并无宫颈移行带T淋巴细胞含量的参考值，甚至关于宫颈移行带T淋巴细胞的报道都很少，所以本研究还有待进一步的深入，但本研究希望能通过一种积极的生活态度、良好的生活习惯来提高人们的免疫力，增强对癌症的战斗力。

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A study of the association between life style intervention and cellular immune function

SHI Tingting1, ZENG Liying1★MO Yun2, LUO Xuan1, JING Wei1, ZHONG Huizhu3, HE Guier4
(1.Department of Clinical Laboratory, Yuexiu Maternity & Child Health Care Hospital, Guangdong, Guangzhou 510055, China; 2.Department of Gynaecology and Obstetrics, Yuexiu Maternity & Child Health Care Hospital, Guangdong, Guangzhou 510055, China; 3.Department of Clinical Laboratory, Guangzhou Maternity & Child Medical Center, Guangdong, Guangzhou 510620, China; 4.Department of Clinical Laboratory, Hexian Memorial Hospital, Guangdong, Guangzhou 511400, China)

Objective To investigate the effect of life style intervention on the ability of immune system to clear up HPV. Methods 258 patients with histologically confirmed HPV infection were recruited and randomly divided into intervention group and control group. Samples of cervical secretion were collected and total T lymphocytes and its subgroups and HPV were quantified using flowcytometry and real time PCR respectively. The measurement was repeated after 6 months. Results HPV clearance in the intervention group was significantly higher than the control group (P＜0.01). No difference was identified between the two groups regarding the total and subgroups of T lymphocytes. Additionally, the treatment could significantly improve the counts of T lymphocytes in the intervention group (P＜0.01), while such effect was not observed in the control group. Conclusion Life-style intervention could improve the immune function and help to clear up the viruses in the HPV-infected patients.

HPV infection; Spontaneous clearance; T lymphocytes

广东省广州市越秀区科技和信息化局医疗卫生类基金（2010-WS-006）

1.越秀区妇幼保健院，检验科，广东，广州 510055 2.越秀区妇幼保健院，妇产科，广东，广州 510055 3.广州市妇女儿童医疗中心，检验科，广东，广州 510620 4.番禺区何贤纪念医院，检验科，广东，广州 511400

★通讯作者：曾丽英，E-mail:18925029249@189.cn