植物甾醇与胆固醇对脂质体膜性质的影响

杨贝贝，曹 栋，耿亚男，聂新艳

(江南大学食品学院，食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡 214122)

脂质体是由脂质双分子层组成，内部为水相的闭合囊泡，在模拟生物膜、药物载体、反应微环境中都有广泛应用。目前，国内外制备脂质体，大多会添加一定比例的胆固醇改善脂质体性质。胆固醇可以减慢氧化磷脂的迁移［1］，抑制溶血磷脂形成导致的膜渗漏［2］。Smith E A 等［3］研究表明，胆固醇会影响脂质体膜的通透性、分子有序性、弹性、取向性、和分子间的空隙大小。胆固醇还可以调节脂质体膜的流动性，提高脂质体的稳定性［4］。但高胆固醇会引发动脉粥样硬化、冠心病等健康问题，随着人们对健康食品的要求提高，可能会限制脂质体在食品药品中的应用。植物甾醇结构与胆固醇类似，不仅可以影响脂质体膜上磷脂分子聚集，调节膜对小分子物质的通透性［5］，改变膜的表面性质［6］，还可以减小胆固醇的肠道吸收［7］。本文主要通过研究不同甾醇对卵磷脂脂质体粒径大小、粒径分布、氧化稳定性、流动性、双分子层内部分子极性的影响，探讨植物甾醇能否替代胆固醇改善脂质体的膜性质，促进脂质体在实际工业生产中的应用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、甲醇、三氯甲烷、无水乙醇、胆固醇、硫代巴比妥酸、三氯乙酸、浓盐酸 均为分析纯，国药集团生产;β－谷固醇(＞95%)、豆甾醇(＞95%) 阿拉丁试剂有限公司;大豆磷脂、大豆植物甾醇 江苏曼氏生物科技有限公司;芘(99.0%)、1，6－二苯基－1，3，5－己三烯(DPH)Sigma－Aldrich公司。

旋转蒸发仪、XMTE－2000 数显恒温水浴锅、SHB－IIIA循环水式多用真空泵 南京予凯仪器设备有限公司;Mettler AL－204电子精密天平 梅特勒－托利多仪器有限公司;F－7000荧光光谱仪 日本Hitach公司;Zetasizer nano ZS纳米粒度仪 英国Malvern公司;KJ－300超声波发生器 无锡市科洁超声电子设备有限公司;WEZ UV－2010紫外可见分光光度计 尤尼柯仪器有限公司;78 HW－1型恒温磁力搅拌器 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 脂质体制备 取0.02g大豆卵磷脂，分别加入磷脂摩尔质量0%、5%、15%、25%、50%的甾醇，溶于30mL氯仿/甲醇(2∶1)混合溶液中，放入玻璃珠，45℃、40r/min旋转蒸发1h，在瓶内壁形成一层薄膜。然后用5mL磷酸盐缓冲液(10mol/L，pH7.4)水化脂质薄膜，形成5mL粗脂质悬浮液，磁力搅拌30min，超声15min，得到脂质体悬浊液。

1.2.2 脂质体粒径大小测定 样品槽经样品溶液润洗后，加入脂质体悬浮液，用ZS纳米粒度仪测定粒径大小，测量温度:25℃，分散介质:H2O，平衡时间:60s。分别测定添加不同比例胆固醇的脂质体粒径大小。

1.2.3 膜抗氧化性测定 取30g三氯乙酸，0.75g硫代巴比妥酸加入到200mL 0.25mol/L的盐酸溶液中，微热溶解，然后取5mL混合溶液和1mL的脂质体溶液于试管中，水浴 30min，在 5000r/min下离心10min，取上清液在532nm测定吸光度。分别制备摩尔百分比15%的甾醇－脂质体，在4℃条件下冷藏，用硫代巴比妥酸法测定不同贮藏时间的吸光值变化。

1.2.4 膜微极性的测定 配制4×10－7mol/L芘的丙酮溶液，取0.1mL的芘溶液于试管中，挥发丙酮，加入5mL稀释5倍的不同甾醇－脂质体溶液，超声1h，放置12h，分别在激发波长338nm，发射波长373nm，384nm 时测定荧光强度［8］。

1.2.5 膜流动性的测定 用磷酸盐缓冲液配制2×10－6mol/L的DPH溶液，取1mL DPH溶液加入到5mL稀释5倍的脂质体溶液中，平衡12h，在 λEx=360nm，λEm=430nm时测定荧光强度。按公式P=(F‖－GF⊥)/(F‖+GF⊥)计算偏振度，其中‖代表激发与发射偏振器平行，⊥代表激发与发射偏振器垂直，G为光栅校正因子。已知偏振度越大，流动性越小［9］。制备摩尔百分比15%的甾醇－脂质体，在25℃和55℃下测定偏振度。

2 结果与讨论

2.1 不同浓度甾醇对脂质体粒径的影响

不同粒径大小的脂质体应用范围不同，一般情况下粒径小的脂质体稳定性较好，但由于体积的减小，其包埋的有效成分也会减少。加入甾醇后，脂质体一般会增大，而甾醇与磷脂间的相互作用可以提高脂质体的稳定性。

2.1.1 胆固醇对脂质体粒径的影响 胆固醇－脂质体的粒径大小和分布结果分别如图1、图2所示。

图1 胆固醇含量对脂质体粒径大小的影响Fig.1 Effect of different amount of cholesterol on particle size of liposome

图2 胆固醇－脂质体粒径分布Fig.2 The particle size distribution of cholesterol－liposome

由图1、图2可知，未添加胆固醇的脂质体，粒径分布较宽，在10～100nm处有个分布很宽的小峰;添加5%胆固醇时脂质体粒径减小，分布变较均匀，可能是少量的胆固醇加入，减小了磷脂双分子层之间空隙，从而使得脂质体的粒径略微减小。当胆固醇含量提高到15%，脂质体粒径变大，分布更加均匀，这说明胆固醇较均匀地嵌入，利于脂质体膜的形成。随着胆固醇含量进一步提高，脂质体粒径继续增大，但是分布变的不均匀，说明过多的胆固醇存在又会不均匀地嵌在脂质体膜中。

2.1.2 β－谷固醇对脂质体粒径的影响 β－谷甾醇－脂质体的粒径大小和分布结果分别如图3、图4所示。

图3 β－谷甾醇醇含量对脂质体粒径大小的影响Fig.3 Effect of different amount of β－sitosterol on particle size of liposome

图4 β－谷甾醇－脂质体粒径分布Fig.4 The particle size distribution of β－ sitosterol－ liposome

由图3可知，随着β－谷甾醇含量的提高，脂质体粒径大小的变化与胆固醇的影响相似，但是β－谷甾醇－脂质体的粒径增大程度比胆固醇－脂质体的要小;由图4可知，β－谷甾醇－脂质体多分散指数更小，分布的更均匀，这可能是由于β－谷甾醇比胆固醇更好的嵌入双分子层。

2.1.3 豆固醇对脂质体粒径的影响 豆甾醇－脂质体的粒径大小和分布结果分别如图5、图6所示。

图5 豆甾醇含量对脂质体粒径大小的影响Fig.5 Effect of different amount of stigmasterol on particle size of liposome

图6 豆甾醇－脂质体粒径分布Fig.6 The particle size distribution of stigmasterol－liposome

由图5、图6可知，随着豆甾醇含量提高，脂质体的粒径逐渐增大，但增大程度比胆固醇与β－谷甾醇的都要高。当豆甾醇摩尔百分比0～15%时，脂质体分布情况变化不大，但是豆甾醇浓度继续增加时，分布变的不均匀，在大于1000nm处也有分布，这可能是由于在脂质体的形成过程中，粒径较大时失去了原有的平衡，从而使得脂质体破裂和重组。

2.1.4 大豆植物甾醇对脂质体粒径的影响 大豆植物甾醇－脂质体的粒径大小和分布结果分别如图7、图8所示。

图7 大豆植物甾醇含量对脂质体粒径大小的影响Fig.7 Effect of different amount of soybean phytosterols on particle size of liposome

图8 大豆植物甾醇－脂质体粒径分布Fig.8 The particle size distribution of soybean phytosterols－liposome

由图7、图8可知，随着大豆植物甾醇含量提高，脂质体粒径也逐渐增大，但是增大的趋势相对不明显。从粒径分布上看，在高浓度时，大豆植物甾醇－脂质体的分布不如β－谷甾醇的均匀，但是比豆甾醇要均匀的多，这是由于大豆植物甾醇中，β－谷甾醇占多数。

2.2 甾醇－脂质体氧化稳定性

丙二醛(MDA)是多不饱和脂肪酸链断裂形成的产物之一，可以与硫代巴比妥酸发生成色反应，在532nm处比色测定，可检测丙二醛相对含量的变化，从而了解磷脂过氧化的程度［10］。脂质体被氧化程度越深，丙二醛含量越高，颜色越深，用紫外分光光度仪在532nm处测量出的吸光值也就越高。结果如图9所示。

图9 贮存时间与氧化程度的关系Fig.9 The relationship between storage time and the degree of oxidation

由图9可知，随着时间增加，吸光度逐渐增大，说明脂质体溶液中丙二醛的含量增多，脂质体被氧化的程度更深。在10d内，添加不同甾醇的脂质体与空白脂质体溶液的氧化程度都不大，这说明脂质体膜保持稳定，10d后脂质体的氧化程度加深，这是由于脂质体膜是个不断运动的平衡态膜，在贮藏过程中，膜上磷脂分子不停交换，导致脂质体的聚集沉淀等，从而破坏脂质体的稳定性。实验结果表明，添加大豆植物甾醇和β－谷甾醇的脂质体，稳定性要高于加入豆甾醇和胆固醇的脂质体。这是由于添加β－谷甾醇与大豆植物甾醇粒径分布均匀，脂质体溶液更加平衡稳定。

2.3 膜微极性

芘是一种脂溶性探针，易分配于脂双层中，在荧光光谱中，荧光强度I1(373nm)与I3(384nm)的比值大小取决于芘所处体系的极性，该值越大表明芘探针所处微环境的极性越大［11］。测定不同浓度的甾醇－脂质体的荧光强度，微极性结果如图10所示。

甾醇与膜结合时，3β－OH与水相结合，侧链延伸到双分子层的疏水核心与磷脂分子的脂肪链结合［12］。由图10可知，加入甾醇，使得膜的微极性逐渐减小，且少量甾醇可较大程度的降低脂质体的微极，说明甾醇分子嵌入到磷脂双分子层中时填充到了磷脂分子的间隙中，避免分子层外部的极性基团影响分子层内部的微极性。当甾醇浓度高时，豆甾醇的微极性比其他甾醇的要大，可能是由于豆甾醇浓度大时容易形成甾醇的富集区，增大分子空隙，所以使得微极性较高。

图10 不同甾醇与膜微极性关系Fig.10 Effects of different kind of sterol on membrane micro－polarity

2.4 膜流动性

脂质体的流动性是脂质体的一个重要物理性质，膜的流动性大，脂质体的稳定性就小、药物释放快［13］。荧光探针DPH是一种疏水性极强的分子，在脂肪酸酰基链中排列较好，常平行排列，更容易结合在双分子层内［14］。DPH在水中的荧光很小，可以忽略［15］，其荧光偏振度(P)结果反映了脂质体烃区的平均活动程度，荧光偏振度越小说明磷脂膜的流动性越大［16］。分别在25℃和55℃下测定甾醇－脂质体的偏振度，结果如表1所示。

表1 不同甾醇－脂质体在25和55℃时偏振度Table1 Different polarization degree of sterol－liposome at 25 and 55℃

由表1可知，空白脂质体在55℃时的偏振度比在25℃时减小很多，这是由于温度升高，分子运动加快，磷脂分子疏水链会有全反式转变为扭曲态，发生相变，会使得膜分子间距增大，流动性降低。与空白脂质体相比，在25℃时，甾醇－脂质体偏振度更小，即流动性更大;55℃时，甾醇－脂质体的偏振度更大，即流动性较小，说明这几种甾醇对脂质体膜的流动性都有一定的调节作用。但是，不同甾醇对膜流动性的调节作用大小不同，胆固醇＞大豆植物甾醇＞β－谷甾醇＞豆甾醇，这是由于胆固醇分子在相变温度以上时，胆固醇、β－谷甾醇弯曲的酰基链链可更好的填充在磷脂分子中，通过范德华作用，限制磷脂脂肪酸链的运动。豆甾醇侧链在C22和C23之间存在的双键不弯曲，流动性较强，在使得豆甾醇对膜流动性的调剂作用相对较小。

3 结论

植物甾醇对磷脂脂质体膜性质的影响与胆固醇类似，虽然胆固醇对脂质体膜流动性调节作用较强，但是β－谷甾醇，大豆植物甾醇调节的脂质体在粒径分布及稳定性方面更优，而且膜内部的微极性小，分子结合更紧密，可以有效的降低膜的渗透率。豆甾醇对膜性质的影响较小，但是可以跟谷甾醇，菜籽甾醇等发挥协同作用改善膜性质，并可以降低胆固醇的危害。因此用β－谷甾醇，大豆植物甾醇替代胆固醇，既生产更加稳定的脂质体，又有益于人体健康。

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