含饱和氢气HC-A肾保存液减轻大鼠肾脏冷缺血再灌注损伤的研究

任恒昌 ，杜洪印 ，喻文立，刘 璐 ，徐如彬 ，于建健 ，王玉亮

（1.天津医科大学一中心临床学院麻醉科，天津300192；2.天津市第一中心医院麻醉科，天津300192；3.天津市第一中心医院手术中心，天津300192；4.天津市胸科医院麻醉科，天津300051；5.卫生部危重病急救医学重点实验室，天津300384）

缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）损伤引起的移植肾功能障碍是影响同种异体肾移植手术治疗效果的重要因素。氧化应激是I/R损伤产生的重要机制。大量细胞毒性氧自由基的产生可引起脂质和DNA的氧化损伤，产生炎症反应，导致肾脏细胞的坏死和凋亡；而坏死细胞释放的各种炎症因子会进一步加重炎症反应，形成恶性循环。因此，减轻细胞毒性氧自由基介导的氧化损伤可能成为改善术后移植肾功能的有效手段。研究表明，氢气具有显著的选择性抗氧化作用，通过各种给药途径（吸入、静脉或腹腔注射含氢生理盐水等）进入实验动物体内后，均能减轻脑、脊髓、心脏和肺脏等器官的I/R损伤[1-3]。近几年，氢气在移植器官保存中的保护作用受到了越来越多的重视。Buchholz等[4]的研究证明在小肠移植的大鼠模型中，含氢的UW液对移植的小肠具有抗氧化、抗炎症的作用，而含氢的肾保存液对移植肾的I/R损伤是否具有保护作用却尚未见报道。本研究采用Takada等[5]报道的大鼠肾脏冷I/R损伤模型，旨在观察含饱和氢气的HC-A肾保存液对大鼠肾脏冷I/R损伤的影响，为临床研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器 HC-A离体肾保存液（上海长征医院）；0.7 mm×19.0 mm的动脉留置针（美国BD公司）；丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性试剂盒（南京建成生物工程有限公司）；半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白-3（caspase-3）活性试剂盒（美国US Biological公司）；全自动生化分析仪（瑞士Roche公司）；Microfuge 22R Centrifuge离心机（美国Beckman coulter公司）；RM2016病理切片机（美国Leica公司）。

1.2 含饱和氢气HC-A离体肾保存液的制备 本研究参照Ohsawa等[6]介绍的方法制备含饱和氢气的HC-A离体肾保存液。抽取4℃HC-A离体肾保存液200 mL充入一真空的密闭容器内，向容器内充入氢气，维持0.4 MPa的压力，6 h后肾保存液中的氢气接近于饱和，采用气相色谱分析法测定其中氢气的浓度，确保氢气的浓度大于0.60 mmol·L-1，制备后的肾保存液于4℃常压保存，于2 d内使用。

1.3 动物分组及模型建立 健康雄性Wistar大鼠24只（中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心），周龄8~10周，体质量200~250 g，采用随机数字表法分为3组（n=8）。（1）对照组（H1组）：腹腔注射5%的水合氯醛溶液（60 mg·kg-1）麻醉大鼠，经腹部脱毛及碘伏消毒后，铺无菌手术单，沿腹正中线逐层打开腹腔，钝性游离双侧肾脏，切除右肾后用温生理盐水冲洗腹腔，缝合腹部切口。术中铺加温毯，监测大鼠肛温，维持大鼠体温高于37.0℃；（2）普通肾保存液组（H2组）：麻醉方法及开腹操作同H1组，开腹后充分游离双侧肾动、静脉，切除右肾，钝性分离左侧肾蒂上下方的腹主动脉和下腔静脉。用无损伤血管夹在左肾动脉开口上、下方阻断腹主动脉，在左肾静脉开口上、下方阻断下腔静脉，用0.7 mm×19.0 mm的动脉留置针行腹主动脉插管，拔出针芯并结扎固定套管，作为灌注通路；在下腔静脉上做一约3 mm的缺口作为流出通路。用4℃普通HC-A肾保存液通过腹主动脉套管对左肾行原位冷灌注，用吸引器及时吸净流出的血液和保存液，灌注液总量10 mL，在2~3 min内完成灌注。灌注完成后在近左侧肾门处夹闭左肾动、静脉45 min，阻断期间用7-0血管线缝合腹主动脉和下腔静脉的缺口，随即移除腹主动脉和下腔静脉的血管夹。45 min后移除左肾肾蒂上的血管夹，恢复左肾血流，用温生理盐水冲洗腹腔后关腹；（3）含饱和氢气肾保存液组（H3组）：麻醉及手术操作同H2组，灌注液及保存液采用自制的含饱和氢气的HC-A肾保存液，按同样方法灌注后关腹。

1.4 样本的采集和观察指标的测定

1.4.1 肾功能检查 H1组大鼠于切除右肾24 h后，H2和H3组于再灌注24 h后经下腔静脉取血2 mL，4000 r/min离心5 min，检测各组大鼠血清BUN和Cr的浓度以评价肾功能。

1.4.2 氧化应激和细胞凋亡检测 抽取静脉血标本后立即处死大鼠，切取左肾，取左肾背面上半个肾组织，剥除结缔组织后在4℃生理盐水中冲洗干净，称取0.5 g肾脏组织块，与生理盐水4.5 g制作组织匀浆，采用MDA含量和SOD活性试剂盒测定组织匀浆中MDA含量和SOD活性以评价氧化应激的水平；比色法检测caspase-3活性以评价细胞凋亡的水平，具体操作按试剂盒说明进行。

1.4.3 形态学检查 取左肾同一部位的部分肾组织，用10%甲醛溶液固定后石蜡包埋后，切成4 μm薄片，行HE染色后于光学显微镜下观察肾组织形态结构的改变。

1.5 统计学处理 应用SPSS18.0统计软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肾功能检查 如表1所示，与H1组相比，H2、H3组BUN和Cr水平升高（P<0.05）；与H2组相比，H3组BUN和Cr水平降低（P<0.05）。

表1 各组大鼠血清中BUN、Cr水平（±s）Tab 1 Levels of BUN and Cr in H1，H2and H3groups（±s）

表1 各组大鼠血清中BUN、Cr水平（±s）Tab 1 Levels of BUN and Cr in H1，H2and H3groups（±s）

与 H1组比较，abP<0.05；与 H2组比较，bP<0.05

组别nBUN（/mmol·L-1）Cr（/μmmol·L-1）H185.77±1.2450.69±7.13 H2817.91±1.45a155.62±8.23a H3810.76±0.97ab106.01±7.74ab

2.2 氧化应激和细胞凋亡检测 如表2所示，与H1组相比，H2、H3组肾组织中 MDA含量和 caspase-3活性升高（P<0.05），SOD活性降低（P<0.05）；与H2组相比，H3组肾组织中MDA含量和caspase-3活性降低（P<0.05），SOD活性升高（P<0.05）。

表2 各组大鼠肾组织中MDA含量和SOD、caspase-3活性（±s）Tab 2 MDA level,SOD and caspase-3 activity in renal tissue inH1,H2and H3group（±s）

表2 各组大鼠肾组织中MDA含量和SOD、caspase-3活性（±s）Tab 2 MDA level,SOD and caspase-3 activity in renal tissue inH1,H2and H3group（±s）

与 H1组比较，abP<0.05；与 H2组比较，bP<0.05

组别nMDA（/nmol·mg蛋白-1）SOD（/NU·mg蛋白-1）caspase-3活性H186.00±1.18132.36±5.071.00±0.20 H2816.87±1.04a62.52±5.23a1.58±0.31a H389.71±1.00ab100.27±7.19ab1.31±0.01ab

2.3 形态学检查 各组大鼠肾组织经HE染色后于光镜下观察结果，如图1所示：H1组肾组织形态结构未见明显异常；H2组可见大量肾小管上皮细胞肿胀，出现明显空泡，上皮细胞坏死脱落，肾小管结构破坏；H3组病理改变较H2组明显减轻，肾小管的病理改变以扩张为主，仅少数肾小管上皮细胞出现空泡，未见明显的结构破坏。

图1 各组大鼠肾组织形态学改变（HE，×200）Fig 1 The pathological changes of kidney in H1,H2and H3groups(HE,×200)

3 讨论

移植肾在恢复血液灌注后会不可避免地产生I/R损伤。在手术过程中，移植肾先后经历了热缺血和冷缺血的过程，大量实验研究采用了夹闭大鼠肾动脉一段时间后再开放的实验模型，即热I/R损伤模型，因为缺少了冷缺血的过程，所以这些模型更适合于休克的研究，不能很好地模拟肾移植过程；而对于大鼠肾移植模型，因需要进行血管吻合，操作复杂，术后血管狭窄、血栓形成等并发症多，同时增加了排斥反应的干扰。本研究所选用的大鼠冷缺血再灌注模型是以Takada等报道的原位肾脏冷灌注模型为基础，增加了冷缺血过程，相对于大鼠肾移植模型具有操作简单、血管损伤少、体循环影响小以及避免排斥干扰等优点，能较好地模拟大鼠肾移植的I/R过程。

氢气是具有还原性的双原子气体，分子量小，电荷中性，且具有良好的脂溶性，容易透过各种生物膜。2007年，Ohsawa等[6]首次报道氢气能够选择性地与羟自由基（OH·）和过氧亚硝酸阴离子（ONOO-）发生直接反应，具有选择性抗氧化的生物效应。由氧自由基介导的氧化损伤和炎性损伤是导致I/R损伤的主要病理基础之一。I/R过程中，氧自由基生成增多，在介导氧化损伤的氧自由基中，以OH·和ONOO-的毒性最强，是导致I/R损伤的重要介质。本研究结果显示，与普通肾保存液组相比，含饱和氢气肾保存液组MDA水平降低，SOD活性升高，提示应用含饱和氢气肾保存液后大鼠肾脏的氧化应激水平降低，可能是由于氢气的选择性抗氧化作用，使得OH·和ONOO-数量减少，从而减轻了由其引发的氧化损伤。

肾小管上皮细胞凋亡是肾功能损害的重要环节，与多种肾脏疾病的发生发展有关。capase-3是细胞凋亡过程中的一个关键酶，在肾小管上皮细胞的凋亡中起重要作用，其活性的高低能间接反映组织细胞的凋亡程度。本研究的结果显示，与普通肾保存液组相比，含饱和氢气肾保存液组的肾组织中caspase-3活性明显降低，提示细胞凋亡水平降低，同时肾功能也明显改善，光镜下观察肾小管上皮细胞的损伤和肾小管结构破坏的程度亦明显减轻。在肾脏I/R损伤过程中，氧自由基可激活多种炎症细胞，释放大量促炎细胞因子，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-1β（IL-1β）等[7]。增多的炎性因子诱导中性粒细胞的活化和迁移渗透，从而引起肾脏局部及全身的炎性反应，导致肾小管上皮细胞的坏死和凋亡。有报道称，TNF-α对肾脏近端肾小管上皮细胞的活性有明显抑制作用并呈剂量依赖性，最终可导致细胞凋亡[8]。IL-6在肾脏再灌注后的炎性损伤中同样具有重要作用。肾小管上皮细胞、单核细胞、中性粒细胞以及部分T淋巴细胞、B淋巴细胞都表达IL-6受体，I/R过程中大量的IL-6与受体结合后能引起肾小管上皮细胞的凋亡，同时活化上述免疫细胞，加重组织损伤[9]。有临床研究也证明，IL-6能明显加重肾移植过程中的肾脏的I/R损伤[10]。Janus激酶/信号转导子和转录激活子（JAK/STAT）信号通路是TNF-α和IL-6导致细胞凋亡的共同途径，二者与肾小管上皮细胞的相应受体结合后促进凋亡相关分子capase-1和capase-3等表达增多，继而诱导细胞的凋亡。结合本研究的结果，氢气减轻肾小管上皮细胞凋亡可能是通过作用于上述信号通路而实现的。氢气的选择性抗氧化作用清除了大量具有细胞毒性的氧自由基，并减轻了由其引发的炎症反应，促炎细胞因子的释放减少，使JAK/STAT信号通路介导的肾小管上皮细胞凋亡程度明显减轻。

综上所述，氢气用于移植肾脏的灌注和保存时表现出明显的抗氧化和抗凋亡的作用，同时HC-A离体肾保存液是国内肾移植手术时常用的器官保存液，用其制备含饱和氢气的肾保存液过程简单，成本低廉，有望为移植器官的保存提供新的途径。

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