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大鼠创伤性脑损伤后创伤区CD34+细胞的聚集与脑水肿预后的关系

2013-07-13王飞飞金学隆刘兴菊陈泽群

天津医科大学学报 2013年1期
关键词:伊文思通透性脑水肿

王飞飞,金学隆,梁 宾,刘兴菊,陈泽群

(天津医科大学生理学教研室,天津300070)

创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI)是神经系统常见疾病,其致残率及致死率高,严重影响人类的健康[1]。TBI后脑水肿是造成继发性脑损伤的主要原因,而损伤后血脑屏障通透性增加不仅能够加重脑水肿,也使炎性成分易于通过血脑屏障加重脑组织损伤[2]。创伤性脑损伤后,由于组织缺血缺氧CD34+细胞代偿性的从骨髓动员到外周血中,并在趋化因子的作用下趋化到损伤区域,分化为内皮细胞,形成新生血管,修复损伤[3]。CD34+细胞在形成新生血管的过程中其与脑水肿预后的关系国内外尚罕见报道。本研究通过大鼠创伤性脑损伤后,损伤脑皮质CD34+细胞数的变化及其与血脑屏障通透性和脑水含量变化的关系,探讨CD34+细胞的聚集对脑水肿的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF清洁级成年健康雄性SD大鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司提供)108只,体质量280~320 g,随机分为假手术组和脑创伤组(TBI组),脑创伤组分为伤后 1、3、5、7、14 d 5 个亚组,每组18只大鼠。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型的建立 选用液压创伤法制作大鼠脑损伤模型[4],大鼠采用20%乌拉坦(5 mL/kg)腹腔注射麻醉后,固定于立体定向仪上,头部备皮消毒,于正中线切开头皮,分离骨膜,暴露颅骨,在大鼠右侧前囟后3 mm,矢状线旁2 mm处,用磨钻磨开直径约为4 mm的圆形骨窗,保持硬脑膜完整。采用玻璃子水门汀固定连接帽于骨窗上,待固定牢固之后,采用液压脑创伤仪(美国NEWSUN公司MODEL01-B)建立大鼠液压脑创伤模型,打击力度为中型:平均为2.14 kPa。打击后常规消毒缝合。假手术组仅行头皮切开,打磨骨窗,不进行打击。

1.2.2 血脑屏障通透性测定 按照Kaya[5]的方法,各组随机取6只大鼠,经股静脉注射2%伊文思蓝3 mL/kg,1 h后用生理盐水心脏灌注。取伤侧损伤中心区脑皮质(约0.3 g)及对侧脑皮质(约0.3 g)分别用电子天平精确称重,放入盛有5 mL二甲基甲酰胺的试管中,37℃水浴孵育48 h,3000 r/min离心15 min,取上清液,用分光光度计在伊文思蓝最大吸收光谱处(λ=632 nm)检测各待测样本光密度值(OD值),根据标准曲线计算伊文思蓝含量(μg/g)。

1.2.3 脑组织含水量测定 各组随机取6只大鼠,用20%乌拉坦腹腔注射(5 mL/kg)麻醉,断头取脑后将大脑分为左右两侧大脑半球,用滤纸吸除表面的水分及血渍,电子天平分别称重,计为湿重,然后于100℃烤箱中烘烤48 h至恒重,计为干重(两次干重之差≤0.001 mg)。脑组织含水量用以下公式计算:脑组织含水量=(湿重-干重)/湿重×100%。

1.2.4 标本制作 各组随机取6只大鼠,麻醉后依次用生理盐水和4%多聚甲醛心脏灌注,取脑组织,以损伤灶为中心,取损伤前后冠状切面3 mm厚脑组织块置于4%多聚甲醛中浸泡固定24 h,取出标本,常规脱水、石蜡包埋,作连续冠状面切片,厚度为6μm,将脑组织贴于预先包被有0.1 mg/mL多聚赖氨酸的清洁玻片上,行HE染色及CD34免疫组化。

1.2.5 免疫组化 参照SABC法,切片经脱蜡、水化后,3%双氧水抑制内源性过氧化物酶,PBS冲洗,置于95~98℃柠檬酸钠中煮20 min以修复抗原,待冷却至室温后用正常兔血清封闭非特异性抗原,滴加一抗(山羊抗大鼠 CD34,多克隆抗体,1∶1000,R&D Systems,AF4117),4℃冰箱过夜,PBS冲洗,加即用型生物素化的兔抗山羊IgG(武汉博士德)37℃温箱中孵育30 min,PBS冲洗,滴加试剂SABC(链酶亲和素-过氧化物酶复合物),37℃温箱中孵育30 min,PBS冲洗,二氨基联苯胺(DAB)显色。阴性对照采用PBS缓冲液替代一抗,其余所加试剂及步骤相同。每张切片在创伤灶周围皮质区选取5个不重叠的高倍视野(×40)拍照进行CD34+细胞计数,染成棕黄色的有核的细胞均视为CD34+细胞。

2 结果

2.1 病理学观察 大鼠中型液压脑损伤的创伤范围局限于损伤侧大脑皮质,伤侧海马及对侧大脑半球均没有损伤。伤后1、3 d损伤区存在大量的出血点,红细胞渗出;损伤微血管内皮细胞肿胀,毛细血管腔塌陷呈缝状,细胞间连接遭到破坏,毛细血管内膜屈曲不平、有断裂,血管周围水肿严重;损伤区域周围有炎性细胞浸润,神经细胞的胞体收缩,胞核深染;伤后7 d损伤区出血点被吸收,有少量红细胞;炎性细胞呈弥漫性的浸润,分布于损伤区域;伤后14 d,坏死组织被清除,炎性细胞减少,内皮细胞肿胀程度减轻,有新生小血管的出现。见图1。

图1 假手术组和TBI组脑皮质病理图Fig 1 HE staining of injured cortex in control group and TBI group

2.2 血脑屏障通透性改变 伤侧脑皮质伊文思蓝含量组间比较有统计学意义(P<0.01),对侧组间比较无统计学意义(P>0.05)。与假手术组相比,大鼠液压脑损伤后伤侧脑皮质伊文思蓝含量增加,1 d明显升高(P<0.01),第 3天达到高峰(P<0.01),从第 5天开始逐渐降低(P<0.01),到14 d含量恢复正常(P>0.05),见表 1。

表1 创伤后双侧大脑皮质伊文思蓝含量变化(μg/g,±s)Tab 1 Changes of evans blue in bilateral cortex after traumatic brain injury(μg/g,±s)

表1 创伤后双侧大脑皮质伊文思蓝含量变化(μg/g,±s)Tab 1 Changes of evans blue in bilateral cortex after traumatic brain injury(μg/g,±s)

与假手术组相比*P<0.01

n666666对侧皮质1.94±0.251.86±0.452.26±0.201.87±0.142.03±0.402.20±0.261.660伤侧皮质3.67±0.6824.01±1.38*29.62±1.28*13.09±1.06*7.27±0.92*4.28±0.54681.559组别假手术组脑创伤组 1 d 3 d 5 d 7 d 14 d F

2.3 脑水含量的改变 伤侧大脑半球脑水含量组间比较有统计学意义(P<0.01),对侧组间比较无统计学意义(P>0.05)。与假手术组相比,脑创伤组伤后1d脑水含量显著增高(P<0.01),3 d达高峰(P<0.01),5 d逐渐降低(P<0.05),7 d进一步降低,但未见统计学意义(P>0.05),14 d 恢复正常(P>0.05),见表2。

表2 创伤后双侧大脑半球脑水含量(%,±s)Tab 2 Changes of brain water content in bilateral cerebral hemisphere after traumatic brain injury(%,±s)

表2 创伤后双侧大脑半球脑水含量(%,±s)Tab 2 Changes of brain water content in bilateral cerebral hemisphere after traumatic brain injury(%,±s)

与假手术组相比 *P<0.01,**P<0.05

n666666对侧半球77.06±0.6677.12±0.7977.52±0.5477.36±0.5177.18±0.4277.19±0.580.488伤侧半球77.49±0.5379.30±0.44*80.89±0.48*78.40±0.47**77.78±0.2777.41±0.5350.973组别假手术组脑创伤组 1 d 3 d 5 d 7 d 14 d F

2.4 CD34+免疫组化结果 脑损伤后1、3 d伤侧脑皮质CD34+细胞数与假手术组相比有所下降(P<0.01),5 d开始增多并超过假手术组(P<0.01),7 d和14d进一步增多(P<0.01)。各组间比较有统计学意义(P<0.01),见表 3。假手术组和脑创伤组 3、14 d 脑皮质CD34+阳性表达免疫组化结果见图2。

表3 创伤后伤侧脑皮质CD34+细胞数改变(±s)Tab 3 Changes of CD34+cells in injured cortex after traumatic brain injury(±s)

表3 创伤后伤侧脑皮质CD34+细胞数改变(±s)Tab 3 Changes of CD34+cells in injured cortex after traumatic brain injury(±s)

与假手术组相比*P<0.01

n666666伤侧皮质10.49±0.846.34±0.68*7.84±0.72*17.10±0.59*24.79±1.05*26.81±0.67*775.159组别假手术组脑创伤组 1 d 3 d 5 d 7 d 14 d F

图2 假手术组和TBI组CD34+阳性表达免疫组化图(×40)Fig 2 Immunohistochemistry levels of CD34+cells in control group and TBI group(×40)

2.5 相关性分析 创伤性脑损伤后损伤侧脑皮质聚集的CD34+细胞数与损伤侧脑皮质伊文氏蓝含量呈负相关(r=-0.840,P<0.01);与损伤侧脑水含量呈负相关(r=-0.957,P<0.01)。

3 讨论

CD34+细胞是一类具有自我更新、多向分化及重建造血和免疫的生物学功能的内皮祖细胞[6]。其在促进血管新生、组织修复、创伤愈合[7]等方面发挥着重要的作用。有报道指出,创伤性脑外伤后,骨髓中的CD34+干细胞快速动员至外周血中,这些细胞在趋化因子作用下趋化到损伤区域[3]。这与我们的实验结果一致:大鼠脑创伤后损伤区域CD34+细胞在伤后5 d开始聚集,随后逐渐增多。聚集的CD34+细胞最终分化为内皮细胞,形成新生血管[8],促进脑功能的恢复[9]。

绝大多数创伤性脑损伤的死亡和病残都与创伤后出现的继发性脑损伤关系密切,而伤后血脑屏障的破坏及脑水肿是引起继发性脑损伤的主要原因[10]。TBI后血脑屏障通透性的改变是参与脑水肿发生发展的重要因素[11]。在我们的实验中发现创伤后脑水含量及血脑屏障通透性的高峰期均在伤后3 d,随后随着血脑屏障通透性下降脑水含量也逐渐恢复至正常水平。

有报道指出在脑外伤后CD34+细胞聚集的过程中伴随着血管内皮生长因子(VEGF)和血管生成素等促血管生成因子[12]的分泌增加。其中VEGF能够促进基质金属蛋白酶9的活化,抑制紧密连接蛋白的表达从而增加血脑屏障的通透性,加重脑水肿[13];而血管生成素-1(Ang-1)能够维持血脑屏障血管稳定性,抑制炎症反应及内皮细胞凋亡,对预防脑水肿有一定的作用[14]。由此可见脑外伤后CD34+细胞的聚集与脑水肿及血脑屏障通透性密切相关。我们通过相关分析发现创伤性脑损伤后损伤侧脑皮质聚集的CD34+细胞数与损伤侧脑皮质伊文思蓝含量呈负相关,说明CD34+细胞对于降低血脑屏障通透性有一定的作用。分析其中可能的原因是随着CD34+细胞聚集及其对内皮的修复,VEGF及Ang-2表达减少,Ang-1在大脑血管内皮的组分表达回到正常的水平[15],Ang-1在干预内皮细胞的炎性反应及稳定血脑屏障通透性方面有着重要作用,而且它能够降低由于VEGF引起的血脑屏障的通透[14]。进一步相关分析发现聚集的CD34+细胞数与损伤侧脑水含量也呈负相关,说明CD34+细胞能够通过影响血脑屏障通透性进而缓解脑水肿的发生。

脑外伤后急性期的治疗已经日趋成熟,但是对于继发性脑损伤的治疗仍然存在挑战。如何减轻脑水肿正成为治疗继发性脑损伤的关键靶点。目前CD34+干细胞移植促进血管新生正成为治疗脑梗死[16]、创伤性脑损伤[17]等脑血管疾病的研究热点,我们的实验结果提示CD34+细胞移植可能在脑损伤后血脑屏障修复减轻脑水肿方面也发挥作用。

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