多功能G3BP应激蛋白的红色及蓝色荧光标记

高星杰 ，葛 林 ，付 雪 ，张 毅 ，宋 娟 ，何津岩 ，姚 智 ,3，杨 洁 ,

（天津医科大学1.基础医学研究中心；2.生物化学系；3.免疫学系，天津300070）

G3BP是一种能够与GAP（the Ras-GTPase-activating protein）的 SH3（Src Homology 3）结构域结合的胞浆蛋白[1]，它在机体发育、细胞周期调控、信号传导通路、应激颗粒及相关疾病的发生发展过程中发挥重要作用。本实验即是在绿色荧光标记的G3BP蛋白基础上，利用pmCheery-C1/pEBFP-N1质粒载体，进一步进行红色与蓝色荧光标记，从而实现活细胞内对于该蛋白的三色荧光标记，有助于进行细胞荧光方面的研究，为深入研究此蛋白的生物学功能提供便利工具。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒、菌株及细胞 真核表达质粒pEGFPC1-G3BP由Jamal Tazi博士馈赠；pmCherry-C1载体由Johan Perane博士馈赠；pEBFP-N1载体购自美国Clontech公司；Tran1-T1感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；HeLa细胞来自本实验室。

1.1.2 酶类及主要生化试剂 限制性内切酶EcoRI、BamHI及T4 DNA连接酶均购自Fermentas公司；Taq酶购自北京鼎国昌盛生物技术公司；T/A载体（pEASY-T1）购自北京全式金生物技术有限公司；B型小量DNA快速回收试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限公司；质粒快速小提试剂盒购自北京索来宝科技有限公司；去内毒素质粒提取试剂盒购自 Promega公司；Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司。BCA蛋白测定试剂盒购自Pierce公司；鼠源抗BFP单克隆抗体购自MBL公司；鼠源抗G3BP单克隆抗体购自Abcam公司；辣根过氧化物酶标记的抗鼠源IgG二抗购自Fermentas公司；LumiGLo化学发光底物购于KPL公司；细胞荧光封片液（含DAPI染料）购自Santa公司。

1.1.3 其它 激光共聚焦荧光显微镜（基础医学研究中心）购自日本Olympus公司；引物合成及基因测序工作由北京天一辉远公司完成。

1.2 方法

1.2.1 目的片段的获取 参照质粒快速小提试剂盒内说明书提取pEGFP-C1-G3BP质粒DNA。根据G3BP（NM_005754.2） 序列设计含有 EcoRI和BamHI限制性内切酶位点的引物序列（表1），以pEGFP-C1-G3BP质粒 DNA为模板，PCR扩增G3BP基因CDS片段，条件为95℃预变性5 min，95℃30 s，60℃45 s，72℃3 min共33个循环，72℃延伸10 min。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，紫外灯下切割含有目的条带的凝胶块，利用凝胶回收试剂盒进行目的片段回收，在T4 DNA连接酶作用下，与pEASY-T1（T/A载体）25℃连接15 min。连接产物转化Tran1-T1感受态细胞，在含有氨苄/卡那霉素的LB平板上筛选克隆。挑取阳性克隆，摇菌扩增并提取质粒。以EcoRI和BamHI进行双酶切，凝胶回收试剂盒回收并纯化各目的片段。

表1 G3BP基因目的片段引物序列Tab 1 The primer sequence of targeting G3BP gene fragment

1.2.2 线性载体的获取 以质粒快速小提试剂盒提取pmCherry-C1/pEBFP-N1质粒DNA，其图谱信息见图1；进行EcoR I、BamHI双酶切后，完整切下线性pmCherry-C1/pEBFP-N1质粒载体，1%琼脂糖电泳分离。凝胶回收试剂盒回收得到约4700 bp线性pmCherry-C1/pEBFP-N1。

图1 pmCheery-C1/pEBFP-N1质粒图谱Fig 1 pmCheery-C1/pEBFP-N1 vector map

1.2.3 重组真核表达质粒pmCherry-C1-G3BP和pEBFP-N1-G3BP的构建 在T4 DNA连接酶作用下，将线性pmCherry-C1/pEBFP-N1质粒载体与具有相同粘性末端的G3BP目的基因片段进行22℃连接过夜。连接产物转化Tran1-T1感受态细胞，在含有卡那霉素的LB平板上筛选克隆。挑取阳性克隆，摇菌扩增并提取重组质粒。

1.2.4 单、双酶切及基因测序鉴定 用EcoR I和BamHI对重组质粒 pmCherry-C1-G3BP和pEBFP-N1-G3BP进行单、双酶切，并以1%的琼脂糖凝胶电泳验证片段的大小。同时，对重组质粒进行基因测序鉴定。

1.2.5 HeLa细胞的转染及荧光显微镜观察 以去内毒素质粒提取试剂盒提取无内毒素重组质粒。HeLa细胞分别接种至60 mm培养皿（用于蛋白印迹检测）或辅有盖玻片的12孔板（用于激光共聚焦观察）中，置于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，37℃、5%的CO2培养箱中培养，至细胞80%汇合时，依据产品说明书进行脂质体瞬时转染pmCherry-C1-G3BP和pEBFP-N1-G3BP。转染后48 h，给予0.5 mmol亚砷酸盐处理1 h，将12孔板内盖玻片取出，并以细胞荧光封片液过夜封片处理，最后以激光共聚焦观察pmCherry-C1-G3BP和pEBFP-N1-G3BP的细胞内表达与定位。

1.2.6 Western印迹检测融合蛋白表达 先以预冷的1×PBS溶液洗涤转染后HeLa细胞3次，加入预冷的NP-40裂解液裂解细胞，晃动培养板数次以确保裂解液完全覆盖细胞，用无菌的细胞刮刮取细胞并转移至一个1.5 mL Eppendorf管中，冰浴20 min。超声破碎细胞后4℃、12000 r/min离心10 min，取上清获得全细胞裂解液，以BCA蛋白测定试剂盒测定总蛋白浓度。裂解液中加入SDS上样缓冲液（50 mmol/L Tris-Cl pH6.8，2%SDS，0.1%溴酚蓝，10%甘油，2.5%β-巯基乙醇），99℃热变性5 min，进行8%SDS-PAGE电泳。电泳结束后，以半干转印法将凝胶上蛋白转移至PVDF膜，用含5%脱脂奶粉的TBST溶液室温封闭2 h，鼠源抗BFP或G3BP单克隆一抗4℃孵育过夜。TBST溶液洗膜3次，每次10 min，加入辣根过氧化物酶标记的抗鼠源IgG二抗室温孵育2 h，TBST溶液再次洗膜3次，每次10 min，最后加入LumiGLO化学发光底物后暗室曝光。

2 结果

2.1 PCR扩增目的片段 利用表1中所设计的引物以pEGFP-C1-G3BP为模板进行PCR扩增，再以1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，结果在1400 bp左右观察到与目的片段长度相符的荧光条带（图2）。

图2 G3BP目的片段Fig 2 Targeting G3BP gene fragment

2.2 线性pmCherry-C1/pEBFP-N1质粒载体的获取 采用EcoRI、BamHI双酶切pmCherry-C1/pEBFPN1质粒，切下完整的线性质粒载体，经1%的琼脂糖凝胶电泳，可在4700 bp左右出现条带（图3），纯化回收后用于后续的连接反应。

图3 线性pmCherry-C1/pEBFP-N1质粒载体Fig 3 Linear pmCherry-C1/pEBFP-N1 plasmid vector

2.3 重组真核表达质粒pmCherry-C1-G3BP和pEBFP-N1-G3BP的鉴定

2.3.1 单、双酶切及测序鉴定 将构建的重组质粒分别进行EcoRI和BamHI的单、双酶切，产生的条带大小与预期相符（图4），重组质粒基因测序结果也正确，证明G3BP目的片段已成功插入到pm-Cherry-C1/pEBFP-N1的多克隆位点上。

图4 pmCherry-C1-G3BP和pEBFP-N1-G3BP的单、双酶切鉴定Fig 4 The single/double enzyme digestion of pmCherry-C1-G3BP/pEBFP-N1-G3BP

2.3.2 荧光显微镜下观察重组质粒表达 在12孔板内进行HeLa细胞爬片处理，脂质体瞬时转染pmCheery-C1-G3BP和pEBFP-N1-G3BP，培养48 h后应激处理并封片过夜，在激光共聚焦显微镜下观察拍照。结果显示在未给予亚砷酸盐（0.5 mmol Arsenite）处理组可观察到红色及蓝色荧光标记的G3BP蛋白表达呈胞浆分布；而给予亚砷酸盐处理组可在胞浆中检测到应激颗粒的形成（图5）。

图5 荧光显微镜下观察重组质粒的表达Fig 5 The expression of recombinant plasmid by fluorescence microscope

2.3.3 Western印迹法检测融合蛋白表达 分别收集转染有pmCheery-C1-G3BP和pEBFP-N1-G3BP的细胞（其中以转染pEGFP-C1-G3BP的细胞为阳性对照），再以针对BFP、G3BP的单克隆抗体检测BFP/Cherry-Red融合蛋白的表达。G3BP蛋白分子量分别为 60 ku，BFP 为 27 ku，Cherry-Red 为 26.7 ku，两者融合后分别为87 ku，86.7 ku。Western印迹法检测出与目的融合蛋白分子量相符的蛋白条带（图6），表明Cheery-G3BP与BFP-G3BP融合蛋白的成功表达。

图6 Western印迹结果Fig 6 Western blot result

3 讨论

研究发现，G3BP是构成应激颗粒（stress granules，SGs）的组分之一。应激颗粒是真核细胞在受到氧化应激、热休克、紫外线照射及病毒感染等各种环境刺激时在胞浆内形成的颗粒物质，是机体的一种保护机制。应激状态下，细胞会通过特定机制中止mRNA的翻译，并在多种蛋白因子的作用下将翻译中止的mRNA运输到SGs中暂时储存起来[2]。G3BP蛋白就是SGs聚集的效应器，常作为SGs的一种标志性蛋白因子[3-4]，如图5B，5D所示。SGs中的mRNA被储存在异常中断的翻译起始复合物中，随后可进入翻译起始或者发生降解[5]。当细胞暴露于亚硝酸盐时，G3BP被招募至SGs。因此，G3BP可能决定细胞应激反应时mRNA的命运。过量表达G3BP也可诱导SGs聚集。此外，研究还发现G3BP可参与NF-kB信号的传导、泛素介导的蛋白质降解、无脊椎动物和脊椎动物的发育、乳腺癌、食管鳞状癌及丙型肝炎的发生、发展等[6-11]，故研究这种多功能蛋白具有非常重要的意义。

本实验将G3BP蛋白基因序列成功插入到pm-Cheery-C1/pEBFP-N1质粒载体中，在已有的绿色荧光G3BP基础上构建红色与蓝色荧光重组质粒，其可与其它功能性的绿色荧光重组质粒共同转染入真核细胞，通过共聚焦显微镜技术进行共定位分析，研究G3BP蛋白与特定蛋白或核酸的结合关系，不断发现新的作用伙伴。比如，我们共同转染pEGFPC1-Tudor-SN、pEBFP-N1-G3BP及 pmCheery-C1-DCP1观察三者的共定位关系；转染pmCheery-C1-G3BP与oligoDT(30)-FITC观察G3BP与mRNA的相关性等。值得注意的是pEBFP-N1-G3BP不适合于活细胞工作站的实时监测，因为其激发光对于细胞有较大的损伤，故仅用其来做普通细胞荧光实验。

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