高效液相色谱法测定白子菜中芦丁的含量

王中华，陈 涛

（天津中医药大学第一附属医院，天津 300193）

白子菜（Crynura divaricata（L.）DC.）为菊科土三七属植物，其根、茎、叶均可入药。其根性味甘、凉,能清热凉血,散淤消肿。其茎、叶性味咸微辛、寒,有毒,具有清热,舒筋,止血,祛痰之功效。白子菜地上部分可作为药食两用之品，广泛用于治疗高血压病、高脂血症及糖尿病等，故有“神仙草”之称。白子菜地上部分含有丰富的黄酮类成分，现代药理学研究也表明，黄酮类化合物有较好的降血糖作用。对于白子菜的研究目前还处于基础阶段。迄今为止，关于白子菜中黄酮类化合物的研究，国内外的报导较少，还没有利用高效液相色谱法对其进行检测和含量测定的相关研究。本文参照高效液相色谱法实验[1]，采用高效液相色谱法对白子菜叶中黄酮类化合物的（以芦丁计）含量进行分析测定，对色谱条件进行优化选择，分析结果表明此法简单快速、准确灵敏。本研究为分析白子菜中黄酮类化合物的药用价值提供相关的理论依据.可为白子菜的开发利用提供相应的参考,具有一定的实用意义。

1 实验材料

1.1 仪器 Waters 600 E高效液相色谱仪；Waters 2998二极管阵列检测器；Waters Empower数据工作站；FA1104电子分析天平（上海精科天平厂）；DK98-1型电热恒温水浴锅（双列六孔、天津中环科技开发公司）；ACO-3120型真空泵（上海会行农机厂）；超声处理器（北京医疗设备二厂）；药典筛（浙江五星冲压筛具厂）；101-2BS电热恒温干燥箱（天津中环实验电炉有限公司）；ZDHW调温型电热套（5000 mL河北省黄骅中性仪器有限公司）；DL-1单联电炉（2000 W北京中兴伟业仪器有限公司）；玻璃仪器等。

1.2 试药与试剂 样品：白子菜（采集于天津中医药大学植物药种植基地，经天津中医药大学药用植物学研究室李天祥教授鉴定为菊科植物白子菜。对照品：芦丁（购自中国药品生物制品检定所，供含量测定用，批号：100080-200707）。甲醇、乙腈，磷酸等为色谱纯，其余试剂均为分析纯；水为蒸馏水。

2 实验方法与结果

2.1 方法学的考察

2.1.1 检测波长的测定 参照《中国药典》2010年版一部“槐花”项下芦丁的检测波长，用Waters 600 E高效液相色谱仪，流动相为甲醇-1%冰醋酸（40∶60），在波长200～600 nm进行扫描，芦丁对照品在360 nm处有最大吸收峰，最终确定360 nm为检测波长。

2.1.2 流动相的考察 参考相关文献[2]，筛选出四组流动相即：甲醇-0.4%磷酸（50:50）；甲醇-2%磷酸（45∶55）；乙腈-0.4%磷酸（20∶80）；甲醇-1%冰醋酸（40∶60）；在相同的检测波长、流速、进样量的情况下，由于前三组出峰时间偏短，基线分离不好，所以最终确定流动相为：“甲醇-1%冰醋酸（40∶60）”，色谱柱:Xterra@RP185um，柱温30℃，流速1 mL/min，检测波长360 nm，进样量20 μL。

2.1.3 提取方法的考察 先将白子菜样品进行前处理,以石油醚（30～60℃）回流提取3 h后干燥备用。然后筛选出三种提取方法即：取样量1.000 g，60%乙醇40 mL超生提取15min；取样量2.000 g，加甲醇20 mL超生提取15min；取样量3.000 g，60%乙醇30 mL与25%硫酸3mL，回流提取3 h后乙酸乙酯萃取[2]。在相同的色谱条件下：进样量20 μL”进行检测，结果显示，取样量1.000 g，60%乙醇40mL，超生提取15 min的条件出峰时间、峰面积、峰型、基线分离度均较好，所以确定其为最佳提取方法。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取芦丁对照品1.00 mg，用甲醇定容至10 mL的容量瓶中，即为芦丁对照品溶液（浓度0.10 mg/mL）

2.2.2 供试品的前处理 取白子菜的地上部分成熟的叶片，去尘土洗净晾干，置于烘干箱内以60℃干燥2.5 h使叶片水分基本蒸发，叶片呈土黄色质脆易碎，药用粉碎机粉碎至能过1 mm孔径筛的粗粉，置于干燥的容器中备用。

精密称取白子菜粗粉3.006 g和3.007 g，分别加石油醚（30～60℃）150 mL，置于索式提取器中回流提取 3 h（料液比 1∶50，水浴温度 55 ℃），滤过，弃去石油醚提取液，药粉残渣置蒸发皿中水浴60℃、20 min挥干石油醚，后置于干燥容器中备用。

2.2.3 供试品溶液的制备 精密称取经前处理的白子菜粗粉1.000 g和1.001 g，各加60%乙醇40 mL（料液比1∶40），置于100 mL三角瓶中称质量，静置30 min，置超声提取器中（频率 50 Hz，功率500 W，温度56℃）提取15 min，取出冷却至常温再称质量，用60%的乙醇补重，过滤，滤液备用[3]。残渣再按以上方法提取一次。合并两次滤液，用60%乙醇分别定容至100 mL的容量瓶中，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，此即为白子菜的供试品溶液。

2.3 线性关系的考察 精密称取干燥的芦丁对照品20.0 mg，加甲醇100 mL配制成0.20 mg/mL的标准液。精密吸取对照品溶液 1、2、3、3.5、5、6 mL 分别置于25 mL容量瓶中，用甲醇定容到刻度，摇匀。精密量取20 μL注入液相色谱仪，记录芦丁峰面积。以对照品浓度（mg/mL）为横坐标，峰面积值为纵坐标进行线性回归的计算，得芦丁标准曲线（如图1），表明在0.0112～0.0672 mg/mL范围内线性关系良好。

2.4 精密度实验 精密吸取上述对照品溶液，连续进样6次，每次20 μL，测定芦丁峰面积的相对标准偏差（RSD）为0.837%，表明仪器精密度良好。

2.5 重复性实验 取经“2.2.2”前处理后白子菜供试品，按“2.2.3”供试品溶液制备操作，按“2.1”方法学考察中确定的色谱条件，连续进样6次，每次20 μL，测得其峰面积的相对标准偏差（RSD）为1.76%，符合要求。

2.6 重现性实验 取经“2.2.2”前处理后白子菜供试品，按“2.2.3”供试品溶液制备操作，配制平行样6份，按“2.1”方法学考察中确定的色谱条件，每次20 μL，计算芦丁平均含量为 0.729（mg/g），相对标准偏差（RSD）为1.49%，符合要求。

2.7 稳定性实验 取经“2.2.2”前处理后白子菜供试品，按“2.2.3”项下制备供试品溶液，以“2.1”方法学考察中确定的色谱条件，分别在 0、2、4、6、8、10、12 h测定，结果芦丁峰面积的相对标准偏差（RSD）为1.76%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.8 加样回收率试验 精密称取经“2.2.2”前处理后的白子菜供试品6份，每份1 g，分别置100 mL具塞锥形瓶中，分别精密加入3 mL芦丁对照品溶液（浓度 0.10 mg/mL），同“2.2.3”项下制备供试品溶液。依法测定结果，结果显示供试品的平均回收率为98.7%，见表1。

表1 加样回收率实验结果（n＝6）Tab.1 Experimental results of average recovery（n＝6）

2.9 样品的含量测定 分别精密吸取供试品溶液20 μL注入高效液相色谱仪，在流动相为甲醇—1%冰醋酸（40∶60），柱温 30 ℃，流速 1 mL/min,检测波长360 nm，每隔2 h进样1次，共进样6次，取平均值按回归方程计算芦丁的含量，结果样品中芦丁的平均含量为 0.729（mg/g），相对标准偏差（RSD）为1.49%（n=6）。（见表 2、图 2、图 3）。

表2 样品的含量测定（n＝6）Tab.2 Assaying of samples（n＝6）

3 讨论

实验结果表明，依据本实验考察确定的检测标准，对白子菜中芦丁的含量采用高效液相色谱法进行测定，其结果芦丁的峰形对称，与相邻杂质峰达到基线分离，芦丁浓度与峰面积极显著相关，回归方程为：y赞=11.298x+0.0521，r=0.9991，结果显示白子菜中芦丁的平均含量为0.729（mg/g）。本方法操作简便，灵敏度和精密度较高，可用于含芦丁天然植物及其制剂的质量控制和检测。

白子菜抗逆性强，已实现人工栽培，栽培容易，生长周期短，产量高，实际生产中每667 m2，年可收获叶和嫩茎5000～8000 kg。对其深入开发和研究可提高其营养价值、使用价值和经济价值，有利于资源的开发利用，可作为绿色天然功能食品，改善人们的膳食结构，提高人们的健康水平。

鉴于白子菜资源丰富，深入研究白子菜提取物的药用和临床价值，尤其是对糖尿病患者的降糖作用机制，以及其对小肠内α-葡萄糖苷酶活性的影响[4]。为其开展对糖尿病的预防和治疗，建立相关的理论基础。

未来还应进一步建立白子菜黄酮类化合物中的槲皮素[5]、以及多糖类成分的含量测定方法和标准。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].北京：中国医药科技出版社，2010.

[2] 王津江.白背三七总黄酮的提取工艺研究[J].中国药师，2009，12（2）：146-149.

[3] 李 辉.超声辅助提取白背三七总黄酮[J].食品科学，2011，32（14）：144-146.

[4] 马正东.白背三七水提取物对2型糖尿病大鼠的降血糖作用及其机制[J].中草药，2010，41（4）：623-626.

[5] 冼寒梅.白子菜药材薄层色谱鉴别的实验研究[J].辽宁中医杂志，2008，35（2）：259-260.