丹酚酸B口服微乳的处方设计及含量测定*

马 丽 ，刘志东 ，李 楠 ，孙精通 ，张 倩 ，叶丽娜

（1.天津中医药大学，天津市现代中药重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地，天津 300193；2.天津中医药大学，现代中药发现与制剂技术教育部工程研究中心，天津 300193；3天津中医药大学中药学院,天津 300193）

丹酚酸B（Sal B）由三分子的丹参素与一分子咖啡酸缩合而成，为丹参的水溶性酚酸类成分，是丹参制剂的主要有效成分。目前，含Sal B的剂型有片剂、粉针剂、注射剂和滴丸剂等。现代药理学研究表明，Sal B具有抗氧化[1]、抗肝脏纤维化及心脏、脑保护等作用[2]。但文献报道，Sal B口服生物利用度极低[3]，大大降低了其临床疗效。Sal B水溶性好，对一些水溶性好而口服吸收差的药物，制成油包水（W/O）型微乳可明显提高其生物利用度。

微乳（ME）是由水相、油相、表面活性剂和助表面活性剂组成的光学上各向同性，热力学稳定的液态体系，粒径在10～100 nm之间，又称纳米乳[4]。微乳剂按照结构分为水包油型、油包水型和双连续型。油包水型微乳能够增溶水溶性药物，提高水溶性药物的稳定性和生物利用度[5]。因此，实验设计制备Sal B的W/O型微乳，以改善其口服吸收。

1 仪器和试药

高效液相色谱仪（COMETRO6000，美国）；C3860A超声清洗器（天津Autoscience公司）；磁力搅拌SZCL-4B（巩义市予华仪器有限责任公司）。

丹酚酸B对照品（天津一方科技有限公司，98%）；丹酚酸B提取物（天津中一制药有限公司）；大豆卵磷脂（PC），（北京美亚斯磷脂技术有限公司）；辛酸/癸酸甘油酯（Miglyol 812，北京凤礼精求商贸有限责任公司）；Maisine 35-1、Labrafil M 1944CS（法国Gattefosse公司）；辛癸酸甘油酯（GTCC）、棕榈酸异丙酯（IPP）、肉豆蔻酸异丙酯（IPM）（浙江物美化学品有限公司）；甲醇、乙腈（天津康科德科技有限公司，色谱纯）；其他均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 W/O型微乳伪三元相图的制备 精密称取表面活性剂和助表面活性剂按一定质量比溶解混匀为混合表面活性剂，取此混合表面活性剂与油相按不同比例（0∶10、1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1、10∶0）混合后加入西林瓶中，滴加至 pH2.0 的水相[9-10]，并不断振摇使体系充分混匀，当体系由澄清透明变浑浊时为临界点，记录临界点时加入水相的量，由油相、水相、混和表面活性剂在临界点的各自质量百分数（W/W）绘制伪三元相图，确定微乳区，M作为标记。AutoCAD2007软件计算微乳区域面积。

2.2 处方筛选

2.2.1 表面活性剂与助表面活性剂的选择 考察表面活性剂PC、司盘80（Span 80）和助表面活性剂1，2-丙二醇、无水乙醇、聚乙二醇 400（PEG400）的互溶情况，初步筛选混合表面活性剂的组成，结果PC与Span 80在1，2-丙二醇、PEG400中皆不溶，二者均溶于无水乙醇，以大豆卵磷脂/无水乙醇（PC/E-tOH）、司盘 80/无水乙醇（Span 80/EtOH）、大豆卵磷脂/司盘 80/无水乙醇（PC/Span 80/EtOH）为混合表面活性剂，IPM为油相，固定Km值为1，制备温度为30℃，绘制伪三元相图，计算微乳区域面积，结果见图1。

图1 乳化剂种类对伪三元相图中微乳区域面积的影响Fig.1 Effect of emulsifier types on the area of microemulsion region in pseudo-ternary diagram

由图1可知，Span 80/EtOH及PC/Span 80/E－tOH与油混合后可以与水相形成微乳，但载水量较低，PC/EtOH与油混合后，载水量较大，微乳区域所占的比例较大，且PC安全无毒，生物相容性好，所以最终确定PC/EtOH为混合表面活性剂。

2.2.2 油相的选择 选用Miglyol 812、GTCC、Maisine 35-1、Labrafil M 1944CS、IPP、IPM 为油相，以PC/EtOH作为混合表面活性剂，固定Km值为1，温度30℃，绘制伪三元相图，考察不同处方微乳区域大小。结果见图2。

由图2可知，采用Maisine35-1、LabrafilM1944CS为油相较Miglyol 812、GTCC、IPP和IPM具有较大的微乳形成区域，载水量较高。其中Maisine 35-1熔点较高，形成微乳黏性较大，以Labrafil M 1944CS为油相，微乳黏度较低且载水量较高。所以选择Labrafil M 1944CS作为油相。

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2.2.3 Sal B加入前后对微乳形成的影响 以Labrafil M 1944CS为油相，PC/EtOH作为混合表面活性剂，固定Km值等于1，实验温度30℃，考察丹酚酸B溶液（45 mg/mL）加入前后对微乳形成的影响。结果见图3。由图3可知，丹酚酸B加入后，其微乳形成区域较空白微乳减小，说明药物自身的性质影响了微乳的形成，由此推测药物浓度可能影响微乳的形成，需要进一步考察。

图3 药物加入前后对伪三元相图中微乳区域面积的影响Fig.3 Effect before and after adding the drug on the area of microemulsion region in pseudo-ternary diagram

2.2.4 药物浓度对微乳形成的影响 以PC/EtOH为混合表面活性剂，Labrafil M 1944CS为油相，固定Km值为1，实验温度30℃，考察考察不同药物浓度（45 mg/mL，22.5 mg/mL）对微乳形成的影响。结果见图4。

图4 药物浓度对伪三元相图中微乳区域面积的影响Fig.4 Effect of the concentration of drug on the area of microemulsion region in pseudo-ternary diagram

由图4可知，丹酚酸B溶液浓度为22.5 mg/mL时微乳形成区域较45 mg/mL时大，但考虑微乳载药量，仍选用丹酚酸B溶液浓度为45 mg/mL作为供试液进行后续的实验。

2.2.5 Km值大小对微乳形成的影响 Km值是影响微乳形成的一个重要因素，以Labrafil M 1944CS为油相，实验温度30℃，药物浓度为45 mg/mL，考察Km值（Km值等于1/2、1、2）对微乳形成的影响。结果见图5。

由图5可知，随着Km值由1/2到2，微乳形成区域逐渐增大，说明增大Km值有利于微乳的形成，但卵磷脂比例大，会造成微乳粘性增强，不利于口服制剂的吸收，所以选择Km为1。

2.2.6 温度对微乳形成的影响 温度可影响微乳的形成，且影响较大，以PC/EtOH为混合表面活性剂，LabrafilM1944CS为油相，考察温度（20℃、30℃、40℃）对微乳形成的影响。结果见图6。

图6 温度对对伪三元相图中微乳区域面积的影响Fig.6 Effect of temperature on the area of microemulsion region in pseudo-ternary diagram

由图6可知，制备温度由20℃变为40℃时，微乳形成区域增大，可能是因为非离子表面活性剂随温度的升高亲脂能力增强，较强的亲脂能力使得表面活性剂渗透到油相并嵌入到界面中，降低表面张力的能力增强，有利于微乳的形成。所以选择40℃为制备温度。

2.3 处方确定 根据实验结果，确定以Labrafil M 1944CS为油相，PC/EtOH为混合表面活性剂，45 mg/mL的丹酚酸B溶液为水相，固定Km值等于1，实验温度40℃，微乳伪三元相图见图7。根据相图分析，以大豆磷脂、无水乙醇、Labrafil M 1944CS和水相组成的微乳体系最佳质量配比为20∶20∶48∶12。

2.4 微乳的鉴定

2.4.1 性状 空白微乳为浅黄色透明溶液，丹酚酸B微乳为橘红色透明液体，二者均为流动性好的均相体系。

2.4.2 高速离心 对水—油—表面活性剂分散体系，如果它是外观透明或近乎透明的，流动性很好的均相体系，并且在100倍重力加速度下分离5 min而不发生相分离，即可认为是微乳液。在1.5 mL离心管中加入1 mL制备的微乳液，放入离心机中，离心（10000 r/min，5 min），观察，微乳液保持澄清透明，未见分层，浑浊，沉淀等现象[11]。

图7 处方组合为Labrafil M 1944CS/大豆卵磷脂/无水乙醇/Sal B 溶液（45 mg/mL）（Km=1）制备温度为（40±1）℃时的伪三元相图。Fig.7 Pseudo-ternary phase diagram of combination of Labrafil M 1944CS/PC/dehydrated alcohol/Salvianolic acid B(45 mg/mL)(Km=1)at ambient temperature of(40±1)℃

2.4.3 稀释法 微乳能被外相无限稀释，如加一滴制备的微乳液于水中，立即散开，则为W/O型的微乳，若不能立即散开，浮于水面，则为W/O型的微乳。将空白微乳及丹酚酸B微乳滴入水中，不能分散开；将其滴入Labrafil M 1944CS中，乳液则散开，并能被油相无限稀释，证明制备的微乳是W/O型。

2.5 微乳的含量测定

2.5.1 溶液的制备 对照品溶液：精密称取丹酚酸B对照品5.31 mg，加甲醇溶解定容，得浓度为212.4 μg/mL的丹酚酸B对照品母液。供试品的制备：精密称取丹酚酸B微乳0.5 g于50 mL量瓶中，用无水乙醇溶解，超声破乳，再用无水乙醇定容[9]。精密量取1mL上述溶液于10mL量瓶中，加水定容。阴性对照溶液：精密称取空白微乳，按供试液的配置方法制备阴性对照品溶液。分别取对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液，进高效液相色谱仪检测。

2.5.2 色谱条件 色谱条件：Agilent ZORBAX SBC18（5 μm，4.6 mm×150 mm）色谱柱，流动相为乙腈-0.3%甲酸（25∶75）（V∶V），流速为 1.0 mL/min，柱温为30 ℃，检测波长为 288 nm，进样量为 20 μL[13]。

2.5.3 标准曲线 精密量取对照品母液适量，加水定容，配制浓度分别为 1.02、5.31、10.62、42.48 及63.72 μg/mL的溶液，进样，记录峰面积。以峰面积A对浓度C进行线性回归，得回归方程为A=12882C+3486.4，r=0.9999，丹酚酸B在1.02～63.72μg/mL范围内线性良好。

2.5.4 精密度回收率 选取低、中、高3个浓度的对照品，在上述色谱条件下进样，低（5.31 μg/mL）、中（10.62 μg/mL）、高（42.48 μg/mL）3 个浓度日内RSD分别为1.11%，1.78%，1.24%（n=5），日间RSD分别为2.29%，1.99%，1.14%（n=3）。表明精密度符合要求。回收率RSD分别为1.11%，1.78%，1.24%（n=5），符合方法学要求。

2.5.5 样品测定 制备3批样品，按上述色谱条件对进行液相测定，结果见下表。

表1 不同批号微乳中丹酚酸B的含量（n=3）Tab.1 The content of Salvianolic acid B in different batch of micro-emulsion（n=3）

3 讨论

伪三元相图中，丹酚酸B的加入对其影响较大，明显减小了微乳区域面积，分析原因可能有以下几种：1）空白微乳，水相为pH2.0的溶液，溶液中有一定量的氯化钠（NaCl），而NaCl可以使表面活性剂中有效的极性部分减少，使得表面活性剂和水相之间氢键的形成更加困难，使微乳形成增加有难度，由此预测水相为pH2.0的溶液较水相为去离子水微乳区稍小。2）丹酚酸B中含有较多的酚羟基，可与水相形成氢键，从而减少了表面活性剂和水相之间氢键的形成，影响了微乳的形成能力，随着丹酚酸B浓度加大，酚羟基增多，从而影响微乳的形成。

本研究通过绘制伪三元相图筛选出了制备水溶性药物丹酚酸B W/O型微乳所用的油相、表面活性剂、助表面活性剂及影响因素并对其进行包载，制得的微乳经鉴定为W/O型，证明了丹酚酸B制备成W/O型微乳的可行性，但微乳体系是否具有能够提高丹酚酸B的小肠黏膜渗透系数，从而提高口服生物利用度还需进一步实验研究。

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