氨氯地平对糖基化低密度脂蛋白诱导的血管内皮功能障碍的修复作用

洪 虹，马小羽，蔡冬梅，蒋丽娟，曹翠平

糖尿病是一种在全球范围内高发的慢性疾病，其动脉硬化的并发症是导致死亡的主要原因之一［1］。内皮功能障碍以内皮细胞促氧化及促炎症反应的增强为特征，是动脉粥样硬化、糖尿病及高血压所共有的一种机体内环境紊乱。动脉粥样硬化是一种慢性炎症反应失调，以巨噬细胞和T淋巴细胞在动脉内膜上的聚集为特征。巨噬细胞在动脉粥样硬化斑块上的聚集主要是由血液中粘附于内皮细胞的单核细胞衍生而来的。单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)是参与循环中单核细胞聚集于炎症靶位的一个主要的趋化因子。在糖尿病患者中可以检测到循环中MCP-1 水平的升高［2-4］。血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)是一种参与单核细胞在内皮细胞上滚动的蛋白质，其在动脉粥样硬化及糖尿病患者中亦有升高［5］。糖尿病中动脉粥样硬化的加速发展可以用血浆葡萄糖水平升高引起糖化蛋白与脂类相互作用而导致血管细胞功能的改变来解释［6-7］。血浆蛋白中的低密度脂蛋白(LDL)在糖尿病环境中被糖基化，这种糖基化的低密度脂蛋白在糖尿病患者中的水平要高于正常对照人群［8］。氨氯地平(Amlodipine，Am)是一种二氢吡啶类L-型钙离子通道阻滞剂，其成功地用于阻止高血脂动物模型的动脉粥样硬化进程［9］，限制糖尿病高血压患者的心血管事件的发生。本研究通过对人内皮细胞进行糖基化低密度脂蛋白(AGE-LDL)的处理来模拟体外糖尿病合并脂代谢异常环境，通过AGE-LDL 诱导人内皮细胞功能障碍，研究氨氯地平修复其功能障碍的相关机制。

1 材料和方法

1.1 试剂 蛋白酶抑制剂、总RNA 分离试剂盒(Sigma-Aldrich 公司);cDNA 扩增试剂(Promega公司)。氨氯地平(Am)(LKT Laboratory)。MCP-1、VCAM-1、β-actin 等的抗体及二抗(Abcam公司);莫洛尼鼠蛋白病毒反转录酶(MMLV-RT)(Invitrogen 股份有限公司);硝酸纤维素膜(Milipore 公司);Western Blot 印迹化学发光试剂(Santa Cruz 公司)。

1.2 低密度脂蛋白(LDL)的离析与糖基化 血浆由健康志愿者的血液中分离。天然LDL(nLDL)利用超速离心法离析。非酶促糖基化LDL(AGE-LDL)的制备通过将LDL 在37 ℃无菌条件下、在含有抗氧化剂(1 mg/mL EDTA +1 μM BHT)的0.2M D(+)葡萄糖中孵育4 周得到［10］。

1.3 细胞培养及细胞分组 人脐静脉内皮细胞(HEC)来自EA. hy926 细胞株(购自ATCC)。细胞在含有5 mM 葡萄糖和10%胎牛血清(FCS)的DMEM 培养基(Dulbecco's modified Eagle Medium)中培养。汇合时，将细胞置于含有0.2% FCS的DMEM 培养基中饥饿，之后将细胞分为3 组:①nLDL 组，在含有100 μg 蛋白/mL nLDL 的培养基中孵育24 h;②AGE-LDL 组，在含有100 μg 蛋白/mL AGE-LDL 的培养基中孵育24 h;③AGELDL +Am 组，在含有100 μg 蛋白/mL AGE-LDL+10 μM Am 的培养基中孵育24 h。24 h 后收集细胞及培养液。

1.4 MCP-1 及VCAM-1 基因表达的定量 分离总RNA，并利用MMLV-RT 反转录。利用MCP-1、VCAM-1 及β-actin 的特定引物应用实时PCR(美国应用生物系统公司StepOne Plus 系统)进行cDNA 扩增(引物序列见表1，引物合成:上海博尚生物技术有限公司)。扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测，并分析各组目的基因的OD 值。上述基因分别以nLDL 组细胞所测值的相对值表示。

表1 MCP-1、VCAM-1、β-actin 引物序列

1.5 培养基中MCP-1 蛋白的定量 收集三组培养液，分别通过Western Blot 检测MCP-1 蛋白含量［11］。MCP-1 蛋白量用其与培养基中总蛋白的相对量表示，以任意单位(A.U.)表示。

1.6 统计分析 应用SPSS 13.0 统计软件，数据用±s 表示，计量资料比较采用t 检验，P ＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 氨氯地平对MCP-1 基因的表达及MCP-1 蛋白分泌的影响与nLDL 比较，AGE-LDL 组MCP-1 mRNA 含量升高1 倍(1.00 ±0.05 升高至2.02 ±0.27，P ＜0.01)，在AGE-LDL 中加入Am后，测得MCP-1mRNA 值明显下降(1.40 ±0.19，30%，P ＜0.01)。见图1。对培养基中MCP-1 蛋白相对量的分析显示，AGE-LDL 组MCP-1 的分泌明显高于nLDL 组，且加入Am 后，MCP-1 的分泌量明显下降(较AGE-LDL 组下降58%，P ＜0.01)。见图2。

图1 各组细胞相对nLDL 组细胞的MCP-1 基因表达水平的相对值

图2 各组培养基MCP-1 蛋白相对培养基中总蛋白值

图3 各组细胞相对nLDL 组细胞的VCAM-1 基因表达水平的相对值

2.2 氨氯地平对VCAM-1 基因表达的影响 与nLDL 相比，AGE-LDL 组VCAM-1 mRNA 表达明显升高(1.00 ±0.03 升至1.24 ±0.07，P ＜0.05)。而AGE-LDL 中加入Am 后，VCAM-1 mRNA 的表达明显下降(0.77±0.06，38%，P ＜0.05)。见图3。

3 讨论

糖尿病通常伴有血脂异常，血管并发症是糖尿病主要的并发症之一。脂代谢异常、高血糖、胰岛素抵抗、糖基化血红蛋白等在其发病过程中均起重要作用。晚期糖基化终末产物(AGEs)是指蛋白质、脂质或核酸等大分子在没有酶参与的条件下，自发地与葡萄糖或其他还原单糖反应所生成的稳定共价物，该反应过程称为非酶促糖基化反应(Maillard 反应)。AGEs 可通过直接或间接的方式对机体多个组织和器官产生病理作用。高糖、氧化应激等状态下机体AGE 可形成加速，血清AGEs 浓度可明显升高［12］。本实验即利用AGE-LDL 模拟高糖及血脂异常环境，研究其对内皮功能的影响。

有研究表明，炎性因子MCP-1 可促进血液中单核细胞迁移至血管内膜，促发血管内膜炎性反应［13］。亦有研究表明，VCAM-1 是启动动脉硬化早期炎症反应和介导单核细胞迁移和渗透的关键步骤［14］。AGE 可通过激活NF-κB 诱发血管内膜炎性反应［15］。本研究显示，AGE-LDL 可上调MCP-1 及VCAM-1 的表达，促进MCP-1 的分泌，从而诱导血管内膜炎症反应的发生。

Ca2+是生物体内非常重要的信号转导因子，主要作为细胞信使传递胞外信号，是多种受体激动后信息传递的中心环节，细胞质内Ca2+水平升高，可触发细胞许多生命活动过程。You 等［16］研究指出，AGE 作用于内皮细胞后，能增加细胞内钙离子含量，并通过Ca2+-NF-κB 途径诱导内皮细胞炎症反应。氨氯地平作为第三代钙离子拮抗剂，已广泛应用于高血压患者的降压治疗当中［17-23］。本研究显示，与AGE-LDL 比较，经Am + AGELDL 处理后的内皮细胞MCP-1 及VCAM-1 的表达明显下降，MCP-1 的分泌亦明显降低。表明氨氯地平可下调血管内皮细胞MCP-1 及VCAM-1基因的表达，在糖尿病合并动脉粥样硬化的血管内皮功能障碍方面具有一定的修复及保护作用。

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