Npu DnaE内含肽构建及其对293T细胞高效反式剪接活性分析

张 矫，崔文静，马祥敏，王雯雯，王 欣

(天津医科大学附属肿瘤医院，乳腺癌防治教育部重点实验室，天津市肿瘤防治重点实验室，天津300060)

蛋白质的反式剪接是一种翻译后蛋白质的成熟过程，即介于中间的多肽序列(内含肽)自动催化将其本身从蛋白质前体中切除，伴随形成肽键连接两端的侧翼序列(外显肽)，形成成熟有功能的蛋白。这种反式剪接广泛应用于蛋白选择性化学修饰、同位素探针标记等生物技术领域［1］。目前，来源于Synechocystis sp．strain PCC6803的天然剪接内含肽DnaE基因(Ssp DnaE)已得到广泛应用。然而，Ssp DnaE在哺乳动物细胞37℃培养条件下剪接能力差，不能达到理想的实验研究要求［2，3］。2012 年 9月～2013年3月，我们应用一种来源于 Nostoc punctiforme PCC73102的内含肽DnaE基因(Npu DnaE)，并通过哺乳动物细胞实验，证实其具有高效的蛋白剪接效率，为其研究与应用提供理论依据。

1 材料与方法

1．1 材料 Phusion Hot StartⅡ DNA polymerase、Pierce BCA Protein Assay Kit蛋白浓度检测试剂盒购自Thermo公司;限制性内切酶 EcoRI、BamHI购自Fermentas公司;琼脂糖凝胶回收试剂盒、In-fusion连接酶、Ecoli DH 5α菌株、质粒提取试剂盒均购自Takara公司;DMEM培养液购自Neuron-biotech公司;胎牛血清(FBS)购自兰州民海生物工程有限公司;Anti GFP-Tag鼠源单克隆抗体及Anti c-myc-Tag鼠源单克隆抗体购自天津三箭生物技术有限公司。293T细胞系、黄色荧光蛋白 Venus质粒、pCDHCMV-MCS-EF1-Puro载体为天津市肿瘤医院肿瘤细胞生物学实验室已有资源。Npu DnaE cDNA由GENEWIZ公司合成(合成时在N片段末尾加入myctag，方便剪接后的抗体检测)。

1．2 方法

1．2．1 引物设计方法 根据 NCBI提供的 Npu DnaE、Venus基因信息设计引物，将Venus的N片段(1～154氨基酸)与Npu DnaE的N片段(1～102氨基酸)连接，构成融合基因 Vn-NDn-myc，与pCDHCMV-MCS-EF1-Puro载体相连。引物设计为:①5'-ATTCTAGAGCTAGCGAATTCGCCACCATGGAGCTGTTCACCGGGGTG-3';②5'-GTCTCGTAGCTCAGGCAGGCGGTGATATAGACGTT-3';③5'-GATCCTTGCGGCCGCTTACAGGTCCTCCTCGCTG-3'。将 Npu DnaE的C片段(103～137氨基酸)与 Venus的 c片段(155～238氨基酸)连接，构成融合基因NDc-Vc，与pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro载体相连。引物设计为:①5'-ATTCTAGAGCTAGCGAATTCGCCACCATGATCAAGATCGCCACCAG-3';②5'-CGTTCTTCTGCTTGTCCATGTTGCTGGCGATGAAGC-3';③5'-ATCCTTGCGGCCGCGGATCCTTAGATCCCGGCGGCGGTCA-3'。

根据In-fusion连接酶的使用原则，引物设计中上下游分别包含 pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro载体EcoRI、BamHI酶切位点前后各15个碱基的同源序列。上游引物包含Kozak序列，提高翻译效率。同时，引物中重新带入EcoRI、BamHI限制性内切酶的识别序列，便于克隆的鉴定。引物由Invitrogen公司合成。

1．2．2 质粒构建方法 扩增Vn-NDn-myc与NDc-Vc cDNA。使用Phusion Hot StartⅡ DNA polymerase进行PCR反应(98℃ 30 s，98℃ 10 s，50℃ 30 s，72 ℃ 30 s，2 个循环;98 ℃ 10 s，63 ℃ 30 s，72 ℃30 s，18个循环)，扩增片段大小分别为830 bp和432 bp。琼脂糖凝胶回收试剂盒回收扩增片段，并定量。

限制性内切酶EcoRI、BamHI酶切pCDH-CMVMCS-EF1-Puro载体，方法同上，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收，并定量。将酶切的 pCDH-CMVMCS-EF1-Puro载体，分别与扩增的 Vn-NDn-myc、NDc-Vc cDNA连接，比例为1∶3～4。In-fusion连接酶2．5～3μL，加入H2O建立15μL连接体系，室温连接30 min后，将连接反应混合物转化 Ecoli DH5α，挑取单个克隆接种在含氨苄霉素的LB培养基中，37℃振荡过夜。取菌液提取质粒，EcoRI、BamHI酶切鉴定。鉴定产物经0．8%琼脂糖凝胶电泳，并在凝胶成像分析仪上成像。构建的质粒经酶切鉴定后送六合华大基因公司测序，经测序比对正确后，再大量扩增。

1．2．3 转染方法 采用Ca2+法。转染前1 d铺种293T细胞于6孔板中，每孔种40×104个细胞，加入2 mL培养液(DMEM+10%FBS+1%PS)，待次日细胞汇合度达到50%。转染时取4μg构建的质粒，加入2 mol/L CaCl214 μL、2 ×HBS 114 μL、H2O 100μL，混匀后加入细胞培养液中。5～7 h后更换2 mL新鲜培养液。培养48 h后荧光显微镜下观察。

1．2．4 蛋白检测方法 采用Western blot法。转染48 h后，6孔板中每孔加入200μL细胞裂解液(lysis Buffer)裂解293T细胞，收集蛋白。酶标仪检测蛋白浓度，各样品分别取30μg上样电泳，转硝酸纤维素膜(NC)过夜。第2天将NC膜转移至封闭液(5%Milk)中，摇床封闭1 h，膜分别孵育Anti GFPTaq和Anti c-Myc-Tag鼠源的单克隆一抗1 h，TBS-T冲洗，孵育荧光标记的鼠源二抗1 h，TBS-T冲洗，仪器扫描，观察结果。

2 结果

2．1 质粒构建结果 虽然出现非特异的条带，但可见明亮扩增的目的条带，位置、大小和设计一致，且与非特异条带分离，不影响切胶回收及后续实验。将构建的 Vn-NDn-myc质粒用 EcoRI、NotI酶切鉴定，可切出817 bp的条带;NDc-Vc质粒用 NheI、BamHI酶切鉴定，可切出398 bp的条带，与扩增的Vn-NDn-myc、NDc-Vc cDNA，pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro(EcoRI、BamHI酶切回收后，7 362 bp)载体相对应(图1)。测序结果经pubmed Blast比对后，证实插入pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro载体的目的基因正确无误。

图1 cDNA扩增及构建质粒琼脂糖凝胶电泳鉴定

2．2 转染结果 Npu DnaE在102与103位氨基酸位点断开形成N片段与C片段，这两部分单独存在时没有活性，但当断裂的N和C片段混合时，两者相互识别，重建催化活性中心，介导蛋白质反式剪接，连接两端的Venus片段，使得荧光蛋白的两个片段在空间上互相靠近互补，重新构建成完整、具有活性的荧光蛋白分子，并在该荧光蛋白的激发光激发下，发射荧光(插页Ⅰ图4A)。转染48 h后观察荧光，发现与293T Wild Type及分别转染 Vn-NDnmyc、NDc-Vc质粒组相比，共转染 Vn-NDn-myc、NDc-Vc质粒细胞出现荧光，且荧光强度与转染Venus wild type质粒相比并无差异，证明Npu DnaE内含肽能够在293T细胞中发挥作用，而且具有很高的剪接效率(插页Ⅰ图4B)。

2．3 蛋白检测结果 anti c-myc抗体检测到Vn-NDn-myc融合蛋白及发生剪接后脱落的NDn-myc蛋白，anti GFP抗体检测到NDc-Vc融合蛋白及Npu DnaE内含肽剪接后形成的完整荧光蛋白，且蛋白大小与实际一致，剪接后形成的完整荧光蛋白大小与Venus wild type也高度一致，进一步证明了 Npu DnaE内含肽能够在哺乳动物细胞中发挥作用，并且具有高效的目的蛋白形成率(图2)。

3 讨论

图2 Western blot检测蛋白结果

蛋白质的化学修饰，如磷酸化、糖基化、脂化、泛素化等可以通过多种方式完成，包括生物整合、化学合成、酶调反应及各种蛋白质连接方法［4～6］。在各种蛋白质连接方法中，蛋白质的反式剪接具有重要地位，不仅应用于制作化学探针、重组蛋白质片段、标记目的蛋白的核心区域，为形成大分子量的蛋白质提供强大的生物学技术;在细胞内形成环状肽，提高肽的稳定性及生物学活性，应用于医药化学领域;还能使建立高通量筛选基因编码库成为可能［7，8］;基于剪接内含肽活性研制的生物传感器也得到应用，如鉴别线粒体蛋白质［9］、监测Caspase蛋白水解酶活性［10］。

研究显示，虽然念珠藻DNA聚合酶Ⅲ内含肽-Npu DnaE与集胞藻DNA聚合酶Ⅲ内含肽-Ssp DnaE蛋白序列具有同源性，即N片段67%(68/102)，C片段53%(19/36)，但Npu DnaE剪接效率是 Ssp DnaE的33～170倍，连接产物形成率为55% ～90%(依据外显肽序列的不同)［11］;在哺乳动物细胞37℃培养条件下，Ssp DnaE剪接效率、连接产物形成率均下降，Npu DnaE则不受影响，原因在于Npu DnaE内含肽活性更为稳定，能够适应两端外显肽末端不同的氨基酸残基序列，尤其是当外显肽末端为芳香族、疏水性氨基酸残基序列时，Npu DnaE内含肽具有更高的剪接活性［12，13］。相比于人工合成的剪接内含肽需经过变性—复性过程才能重组蛋白质的活性，且对蛋白质重新折叠和发挥剪接功能的环境要求严格，Npu DnaE内含肽的剪接功能不需要任何外部力量及辅助因子的影响，同源的Npu DnaE内含肽N片段与C片段即使在低浓度的条件下也能发生剪接反应，进一步提高了其在分子生物学中的应用前景［13～15］。

本实验利用双分子荧光互补技术(BiFC)将荧光亮度强、化学结构稳定、成熟时间短、便于及时观察的荧光蛋白Venus片段分别连接到具有相互作用的Npu DnaE内含肽片段上，构建质粒。在细胞内共表达这两个融合蛋白时，由于Npu DnaE内含肽N片段与C片段的相互作用，荧光蛋白Venus的两个片段在空间上互相靠近、识别，重新构建成活性荧光蛋白分子，并发射荧光，通过检测功能蛋白质Venus的活性来判断目标蛋白质Npu DnaE内含肽的相互作用，证明Npu DnaE内含肽能够在哺乳动物细胞37℃培养条件下发挥反式剪接的生物学功能，剪接活性不受温度升高的影响，并且具有高效的剪接效率及功能目的蛋白的形成率，为临床及科研实际应用提供有力依据。

［1］Volkmann G，Iwai H．Protein trans-splicing and its use in structural biology:opportunities and limitations［J］．Mol Biosyst，2010，6(11):2110-2121．

［2］Shi J，Muir TW．Development of a tandem protein trans-splicing system based on native and engineered split inteins［J］．JAm Chem Soc，2005，127(17):6198-6206．

［3］Martin DD，Xu MQ，Evans TC．Characterization of a naturally occurring trans-splicingintein from Synechocystis sp．PCC6803［J］．Biochemistry，2001，40(5):1393-1402．

［4］Hackenberger CP，Schwarzer D．Chemoselective ligation and modification strategies for peptides and proteins［J］．Angew Chem Int Ed Engl，2008，47(52):10030-10074．

［5］Kent SB．Total chemical synthesis of proteins［J］．Chem Soc Rev，2009，38(2):338-351．

［6］Fong BA，Wu WY，Wood DW．The potential role of self-cleaving purification tags in commercial-scale processes［J］．Trends Biotech nol，2010，28(5):272-279．

［7］Vila-Perello M，Muir TW．Biological applications of protein splicing［J］．Cell，2010，143(2):191-200．

［8］Flavell RR，Muir TW．Expressed protein ligation(EPL)in the study of signal transduction，ion conduction，and chromatin biology［J］．Acc Chem Res，2009，42(1):107-116．

［9］Ozawa T，Sako Y，Sato M，et al．A genetic approach to identifying mitochondrial proteins［J］．Nat Biotechnol，2003，21(3):287-293．

［10］Kanno A，Yamanaka Y，Hirano H，et al．Cyclic luciferase for real-time sensing of caspase-3 activities in living mammals［J］．Angew Chem Int Ed Engl，2007，46(40):7595-7599．

［11］Zettler J，Schutz V，Mootz HD．The naturally split Npu DnaE intein exhibits an extraordinarily high rate in the protein trans-splicing reaction［J］．FEBSLett，2009，583(5):909-914．

［12］Iwai H，Zuger S，Jin J，et al．Highly efficient protein trans-splicing by a naturally split DnaE intein from Nostoc punctiforme［J］．FEBSLett，2006，580(7):1853-1858．

［13］Otomo T，Teruya K，Uegaki K，et al．Improved segmental isotope labeling of proteins and application to a larger protein［J］．J Biomol NMR，1999，14(2):105-114．

［14］Cheriyan M，Pedamallu CS，Tori K，et al．Faster protein splicing with the Nostoc punctiforme DnaE intein using non-native extein residues［J］．JBiol Chem，2013，288(9):6202-6211．

［15］Ramirez M，Valdes N，Guan D，et al．Engineering split intein DnaE from Nostoc punctiforme for rapid protein purification［J］．Protein Eng Des Sel，2013，26(3):215-223．