白花丹参水提物对糖尿病大鼠神经病变的干预作用观察

黄东辉，李 菁，辛 燕，郭征东，夏作理

(1泰山医学院临床学院，山东泰安271000;2泰安市中医二院;3济南市中医院;4泰山医学院附属医院)

糖尿病性周围神经病变(DPN)是糖尿病常见的慢性并发症之一。糖尿病患者中DPN的发病率可高达60% ～90%，其中30% ～40%的患者无症状［1］。DPN发病与多种因素有关，如神经纤维蛋白糖基化和维生素缺乏、神经滋养血管损伤、神经生长因子减少等［2，3］。泰山白花丹参是丹参的变种，是山东特有珍稀濒危药用植物，主产于泰山，该中药材已经广泛用于防治冠心病、脑血管病和外周血管的多种病变，具有较好的降糖、调脂、改善血流变的作用。2012年9月～2013年2月，我们对白花丹参水提物对糖尿病大鼠神经病变干预作用进行了相关研究。现报告如下。

1 材料与方法

1．1 实验动物 健康雄性Wistar大鼠90只(山东鲁抗公司实验动物中心提供)，体质量200～220 g。适应性喂养7 d后，禁食12 h，自由饮水，随机选出12只作为空白对照组，标准饲料饲养。余78只制备糖尿病模型，予以高脂饲料饲养。高脂饲料配方:2．5%胆固醇，10%猪油，20%蔗糖，胆酸盐1%，常规饲料66．5%。

1．2 实验试剂与仪器 白花丹参均产自莱芜苗山白花丹参种植基地，经泰山医学院生药教研室苏延友教授鉴定为泰山白花丹参。白花丹参水溶性提取物制备:称取白花丹参根适量，切片后加蒸馏水浸泡2 h，加热煮沸，开始用强火，沸腾后改用文火，保持微沸30 min，搅拌、趁热过滤;药渣再加蒸馏水同法煮沸后30 min，滤过;合并滤液，经旋转蒸发仪浓缩，最后用蒸馏水稀释至所需浓度灌封，4℃保存备用。链脲佐菌素(STZ)购自北京博爱科贸有限公司;甲钴铵(批号:20120912)购自石药集团欧意药业股份有限公司;血清神经生长因子(NGF)试剂盒(批号:12090319)购自上海森雄生物制品有限公司;cGMP试剂盒(批号:20120917)和cAMP试剂盒(批号:20121011)均购自长沙力生科贸有限公司实验试剂耗材部。血糖仪为美国罗氏公司产品。

1．3 方法

1．3．1 糖尿病模型的制备及分组 78只大鼠高糖高脂饲料喂养1个月后，用0．1 mol/L(pH 4．5)的枸橼酸钠缓冲液新鲜配成10 g/L的STZ溶液，按照40 mg/kg一次性腹腔注射STZ，注药后72 h尾尖取血测血糖，将血糖≥16．7 mmol/L者确定为糖尿病模型［4］，共60只进入实验。将60只造模成功大鼠随机分为5组:模型组，白花丹参小剂量组［15 g/(kg·d)］，白花丹参中剂量组［30 g/(kg·d)］，白花丹参大剂量组［45 g/(kg·d)］，甲钴胺组［17．5 mg/(kg·d)］。各组大鼠均给予每天灌胃给药1次，灌胃容积均为10 mL/kg，模型组给予等量的生理盐水灌胃;空白对照组标准饲料饲养的同时，给予等量的生理盐水灌胃，连续12周。

1．3．2 观察方法与指标测定

1．3．2．1 坐骨神经传导速度测定 给药第6周末及第12周末测定坐骨神经传导速度。运动神经传导速度(MNCV)测定:将10%水合氯醛按350 mg/kg标准腹腔注射麻醉，麻醉后俯卧位固定。刺激针电极置于坐骨切迹处的坐骨神经传出部位，于踝关节坐骨神经经过部位，参考电极在刺激电极与记录电极之间距离记录电极1 cm处。用单脉冲方波刺激，波宽0．1 ms，刺激强度1．5倍阈值。每两个刺激之间间隔5 s以上。严格控制室温(20±5)℃，保持动物体温37℃。计算机记录从刺激神经开始到远端肌肉出现动作电位的时间，即潜伏期。重复测定7～10次，计算平均值。将动物后足以自然肢体状态与脊柱成45°向斜后方拉直，沿动物体表准确测定刺激电极到记录电极之间的距离。MNCV(m/s)=刺激电极与记录电极间的距离/潜伏期，计算坐骨结节到踝关节处的 MNCV。感觉神经传导速度(SNCV)测定:刺激电极与记录电极的位置与测定MNCV时相反。SNCV的计算方法同上。每6周测定1次大鼠坐骨神经传导速度(MNCV和SNCV)。

1．3．2．2 血清NGF测定 给药结束后(12周末)，各组大鼠股静脉采血，分离血清后采用ELISA法测定大鼠血清NGF含量，按照试剂盒说明操作。

1．3．2．3 坐骨神经内 cAMP、cGMP含量测定 测定MNCV和SNCV后，分离大鼠双下肢肌肉组织，取出两侧坐骨神经组织，冰浴环境内，按照每50 mg神经加2 mL 50 mg醋酸缓冲液(pH 4．75)匀浆，匀浆液60℃水浴中吹干，－20℃冰箱保存。cGMP和cAMP均采用放射免疫法测定，严格按照试剂盒说明操作。

1．3．3 统计学方法 采用SPSS13．0统计软件。计量资料以¯x±s表示，采用t检验，3组间比较采用方差分析，多个样本均数之间的两两比较采用q检验，各指标间的相关分析用Pearson相关分析法。P≤0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 各组大鼠空腹血糖(FPG)、NGF、cAMP、cGMP水平比较 给药第12周末，白花丹参对各组大鼠FPG、NGF、cAMP、cGMP 的影响见表1。

2．2 各组大鼠SNCV和MNCV比较 给药第6周末及第12周末各组大鼠SNCV和MNCV比较见表2。

3 讨论

DPN可累及周围神经、植物神经和中枢神经，其中以对称性的周围神经病变最为多见和典型，是糖尿病患者致残的主要原因，严重影响患者生活质量。其病理变性首先累及感觉神经，可见神经纤维发生节段性髓鞘脱失，严重时可伴有轴索变性，有些纤维出现髓鞘再生现象。坐骨神经、正中神经、腓神经、胫后神经、股神经等周围神经组织病理均有类似的表现。STZ诱导大鼠模型早期的神经功能和生化异常变化与人类DPN发生相似，在造模2周后就可以明显出现［5，6］。DPN的发生和发展是糖代谢异常和神经微循环障碍共同参与的结果［7，8］，与氧化应激［9，10］、NGF 缺乏也有一定关系［11］，NGF 可促进神经中血管的再生和血管活性因子的产生［12］。

表1 给药第12周末各组大鼠FPG、NGF、cAMP、cGMP水平比较(¯x±s)

表2 给药第6周末及第12周末各组大鼠SNCV和MNCV比较(m/s，¯x±s)

目前的治疗方式主要是控制血糖，改善局部微循环和神经营养。甲钴胺是维生素B12的衍生物，是目前最常用的治疗DPN的药物，可参与神经纤维蛋白的甲基转换［13］，通过促进神经组织内的核酸、蛋白质及卵磷脂的合成，促进神经髓鞘形成和轴突再生，提高坐骨神经中cAMP及cGMP的含量，从而修复受损的神经细胞，提高Na-K-ATP酶的活性，提高神经血管的通透性，改善神经内膜缺氧，改善神经传导速度。

本研究显示，经过12周的白花丹参水溶物干预治疗后，白花丹参各剂量组大鼠的SNCV和MNCV均有不同程度改善，其中以高剂量白花丹参组改善最为明显，呈现一定的量效关系;大剂量组效果优于甲钴胺组，原因除了白花丹在参可以明显降低血糖外，与其尚可以有效提高 NGF、cAMP含量，降低cGMP含量有关。该实验结果说明白花丹参在预防、治疗糖尿病神经病变方面有较好的应用价值，可在药物开发方面进一步推广使用。

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