传代和冻存对胎肺间充质干细胞生长及分化的影响

范存刚，周景儒，张庆俊，王栋梁

(北京大学人民医院，北京100044)

间充质干细胞(MSCs)易于获得和扩增，具有向神经细胞分化的潜能，在细胞移植治疗神经系统疾病中具有广泛的应用前景［1］。由于在短时间内所能获得的细胞数量往往是限制干细胞临床应用的瓶颈，故本研究拟在先前成功分离人胎肺MSCs研究的基础上［2］，于2012年4月～2013年2月进一步探讨体外传代扩增和冻存复苏对人胎肺MSCs形态、表型，特别是神经分化潜能的影响，从而为快速获得具有神经分化潜能的MCSs提供依据。

1 材料与方法

1．1 材料 DMEM、胎牛血清(FBS)、左旋谷胺酰胺、青链霉素、胰酶、胰岛素—转铁蛋白—硒-A、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)均为美国Gibico公司产品。流式细胞学检测抗体 CD13-PDE、CD14-FITC、CD29-PE、CD31-FITC、CD34-PE、CD38-PE、CD41a-PE、CD42b-PE、CD44-FITC、CD45-FITC、CD49d-FITC、CD61-FITC、CD90-FITC、CD106-PE、CD133-PE、CD166-PE、HLA-DR-PE、FITC-和 PE-标记的 IgG1 同型对照均购于美国BD Pharmingen公司，CD105-FITC购于美国Ancell公司。纯化的小鼠抗人HLA-ABC、兔抗小鼠FITC标记的二抗、DMSO、丁羟茴醚(BHA)、氯化钾、丙戊酸和氢化考地松、Triton X-100、抗生物素—生物素复合物、DAB和苏木素均购于美国Sigma公司。弗斯扣林购于瑞士Alexis公司。小鼠抗人神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体(NSE)、兔抗人神经微丝多克隆抗体(NF)、小鼠抗人Ⅲ型-β-微管蛋白单克隆抗体(TUJ1)、过氧化物酶偶联的兔抗小鼠IgG和羊抗兔IgG均购自美国Chemicon公司。

1．2 方法

1．2．1 细胞分离和培养 无菌条件下采集人工流产胎儿的肺组织，以PBS洗涤后剪成1～2 mm3组织块，以0．1% Ⅱ型胶原酶于37℃孵育40 min，PBS洗涤并收集细胞悬液，经离心后再以5×104/mL的密度接种。次日换液并弃去未贴壁细胞，此后每3 d换液1次，待贴壁细胞达60% ～80%汇合后以0．20%胰酶/0．02%EDTA 液消化，按1∶3比例进行传代培养［2，3］。

1．2．2 细胞冻存 收集对数生长期的细胞，以10%二甲基亚砜、20%FBS和70%LG-DMEM的冻存液重悬后置于程序降温盒中，于－80℃冰箱过夜后转入液氮长期贮存。

1．2．3 细胞复苏 自液氮中取出细胞，放于37℃水浴箱中并缓慢震荡，待冰晶即将完全溶解时吸取细胞悬液，洗涤、离心后重新接种。

1．2．4 细胞表型分析 收集对数生长期细胞，以PBS洗涤后1×106/50μL分装于流式细胞管，向各管内分别加入PE和FITC标记的各种抗体及同型对照，于4℃避光孵育30 min，PBS洗涤和1%多聚甲醛固定后进行流式细胞分析［2］。

1．2．5 神经分化诱导方案 采用我们以往曾使用的诱导脐带MSCs向神经细胞分化类似的改良Woodbury神经诱导方案［3，4］。将 MSCs以 5 × 104/mL接种于24孔板，达到60% ～80%汇合后，以含有20%FBS和10 ng/mL bFGF的DMEM预处理过夜，然后以含2%DMSO、200μmol/L BHA的DMEM诱导6 h，再向培养液中加入终浓度为25 mmol/L KCl、2 mmol/L丙戊酸、10 μmol/L弗斯扣林、1 μmol/L氢化考地松和1%胰岛素—转铁蛋白—硒-A。

1．2．6 神经表型分析 采用免疫组化法。神经分化诱导结束后，依次以4%多聚甲醛固定15 min后以PBS冲洗，以 0．1%Triton X-100 4℃透膜20 min，以3%双氧水中和内源性过氧化物酶15 min，以含有10%FBS和5%牛血清白蛋白的PBS阻断非特异性结合。然后，分别以一抗NSE(1∶200)、NF(1∶300)和 TUJ1(1∶200)于4℃孵育过夜，以PBS洗涤2次，以过氧化物酶偶联的兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG二抗孵育45 min，以抗生物素—生物素复合物孵育15 min，再以 DAB显色、苏木素复染细胞核。

1．2．7 统计学方法 采用SPSS13．0统计软件。数据以¯x±s表示，组间比较采用t检验。P≤0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 胎肺MSCs的形态 胎肺细胞原代培养24 h后可见均一的长梭形贴壁细胞，2周内达到汇合。经传代扩增和冻存复苏后细胞仍保持均一长梭形，无明显变化。见插页Ⅰ图1。

2．2 胎肺MSCs的免疫表型 流式细胞学分析表明，传代扩增和冻存复苏后细胞表面标志物表达情况未发生明显变化，仍表达 MSCs标志物 CD13、CD29、CD44、CD105、CD90和 CD166，也表达 HLA-ABC;但不表达造血细胞系标志物 CD45、CD34、CD14、CD38、CD133和内皮相关抗原 CD31，也不表达 CD41a、CD42b、CD49d、CD106、CD61和 HLA-DR。

2．3 胎肺MSCs的神经分化潜能 经神经分化诱导后，细胞胞体逐渐皱缩并伸出双极或多极突起。随着诱导时间延长，细胞胞体皱缩为圆性或椭圆形，突起数目增多并延长，甚至伸出次级突起并相互交织成网状。免疫组化分析显示，全程诱导后NSE、NF-M和TUJ1阳性细胞率分别为55．2% ±4．1%、79．6% ±3．6% 和 71．9% ±4．5%，与冻存前的神经分化阳性细胞率相比差异无统计学意义。见插页Ⅰ图2。

3 讨论

成人体内神经干细胞的数量有限，使得中枢神经系统疾病或损伤后难以通过内源性神经干细胞完成自身修复，故细胞移植治疗神经系统疾病成为当前研究热点［5］。基于神经干细胞的上述不足［6］，以及胚胎干细胞纯化困难和形成畸胎瘤的风险，使易于分离和扩增的MSCs成为治疗神经系统疾病理想的备选细胞来源［7，8］。

新近有研究显示，胎儿组织中不仅MSCs的含量高于成人组织，其细胞的增殖和分化能力也更强［9，10］。然而，自胎儿骨髓、肝、脾中分离 MSCs 往往需要以流式或磁珠分选去除造血细胞污染［11］，不仅技术较为复杂、耗时长，还可能影响细胞活力并增加细菌污染的风险。为此，我们对从胎肺组织中分离MSCs的可行性进行探讨，并成功培养出具有神经分化潜能的胎肺MSCs［2］。鉴于在短时间内所能获得的细胞数量往往是限制干细胞临床应用的瓶颈，加之MSCs在神经系统疾病中的广泛应用前景［12］，故我们进一步对体外传代扩增和冻存复苏的人胎肺MSCs的形态和表型，特别是向神经元样细胞分化的潜能进行深入研究，从而为快速获得具有向神经元样细胞分化潜能的MCSs提供依据。

与付霞霏等［13］对大鼠骨髓 MCSs生物学性质的研究结果相似，本研究所显示长期传代扩增和冻存复苏后人胎肺MSCs仍保持贴壁生长，呈长梭形，增殖能力和表面标志物的表达未发生明显变化。更重要的是，采用改良Woodbury神经诱导方案能使冻存复苏的人胎肺MSCs高效地分化为神经元样细胞［3，4］，提示冻存后复苏的胎肺 MSCs有望成为快速获得神经元样细胞的种子细胞，以便用于神经系统疾病的治疗。此外，本研究中的流式细胞学分析还揭示了胎肺MSCs的免疫分子特征，即胎肺MSCs表达HLA-ABC但不表达HLA-DR。由于异体移植排斥通常是HLA分子介导的，胎肺MSCs的上述免疫特征有助于降低异体移植的排斥反应［14，15］，可能在异体细胞移植中有一定的应用前景。

由此可见，胎肺MSCs易于分离和扩增，并具有较强的增殖能力和向神经元样细胞分化的能力，且经多次传代扩增和冻存复苏后上述生物学性质保持稳定。加之胎肺MSCs的免疫原性较弱，故传代扩增和冻存复苏的胎肺MSCs可作为快速获得神经元样细胞的理想途径，在治疗神经系统疾病中有一定的应用前景。

［1］Drela K，Siedlecka P，Sarnowska A，et al．Human mesenchymal stem cells in the treatment of neurological diseases［J］．Acta Neurobiol Exp(Wars)，2013，73(1):38-56．

［2］Fan CG，Tang FW，Zhang QJ，et al．Characterization and neural differentiation of fetal lung mesenchymal stem cells［J］．Cell Transplant，2005，14(5):311-321．

［3］Woodbury D，Schwarz EJ，Prockop DJ，et al．Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons［J］．J Neurosci Res，2000，61(4):364-370．

［4］范存刚，张庆俊，韩忠朝．人脐带间充质干细胞神经分化的研究［J］．中华神经外科杂志，2005，21(7):388-393．

［5］Neirinckx V，Coste C，Rogister B，et al．Concise review:adult mesenchymal stem cells，adult neural crest stem cells，and therapy of neurological pathologies:a state of play［J］．Stem Cells Transl Med，2013，2(4):284-296．

［6］O'Donoghue K，Chan J．Human fetal mesenchymal stem cells［J］．Curr Stem Cell Res Ther，2006，1(3):371-186．

［7］范存刚，周景儒，张庆俊．人脐带间充质干细胞治疗神经系统疾病的研究进展［J］．国际神经病学神经外科学杂志，2009，36(3):48-51．

［8］范存刚，周景儒，张庆俊．人充质干细胞的分离［J］．山东医药，2013，53(40):23-25．

［9］Fan CG，Zhang QJ，Zhou JR．Therapeutic potentials of mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord［J］．Stem Cell Reviews and Reports，2011，7(1):195-207．

［10］O'Donoghue K，Chan J．Human fetal mesenchymal stem cells［J］．Curr Stem Cell Res Ther，2006，1(3):371-186．

［11］in't Anker PS，Noort WA，Scherjon SA，et al．Mesenchymal stem cells in human second-trimester bone marrow，liver，lung，and spleen exhibit a similar immunophenotype but a heterogeneous multilineage differentiation potential［J］．Haematologica，2003，88(8):845-852．

［12］任超，刘小云，万美荣，等．自身骨髓间充质干细胞及其分化的神经干/前体细胞移植治疗神经系统疾病临床观察［J］．山东医药，2012，52(42):53-55．

［13］付霞霏，何援利．体外培养、冻存及复苏对大鼠骨髓间充质干细胞生物学特性的影响［J］．山东医药，2008，48(6):38-40．

［14］Nery AA，Nascimento IC，Glaser T，et al．Human mesenchymal stem cells:from immunophenotyping by flow cytometry to clinical applications［J］．Cytometry A，2013，83(1):48-61．

［15］Shi M，Liu ZW，Wang FS．Immunomodulatory properties and therapeutic application of mesenchymal stem cells［J］．Clin Exp Immunol，2011，164(1):1-8．