血脉通颗粒对动脉粥样硬化小鼠外周血单核细胞 TLR4、IL-6、TNF-α 的影响

丁志祥，钱高潮，张 琪

(南京中医药大学附属常州市中医医院，江苏常州213003)

动脉粥样硬化(AS)是一种多病因的慢性炎症性疾病，局部和全身的炎症免疫反应在动脉粥样硬化发生发展过程中起着重要作用，固有免疫和适应性免疫共同参与调节动脉粥样硬化病变。Toll样受体(TLR)是一种介导天然免疫的跨膜信号传递受体，属于模式识别受体，在细胞活化信号转导中起重要作用［1］。近年来多项研究［2～4］显示，TLR 介导的天然免疫及慢性炎症与AS的发生发展密切相关。白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)是体内重要的致炎因子，参与AS炎症损伤。前期我们对中医药干预治疗颈动脉粥样硬化(CAS)进行了研究，以滋肾泄浊化痰法研制的血脉通颗粒治疗CAS取得了一定疗效［5，6］。2011年6月 ～2013年6月，本研究观察血脉通颗粒对AS小鼠外周血单核细胞TLR4的表达和IL-6、TNF-α水平的影响，以探讨血脉通颗粒防治AS的作用机制。

1 材料与方法

1．1 材料 遗传背景为C57BL/6J的雄性apo E基因敲除(apo E－/－)小鼠 24只，体质量 18～20 g，6周龄，购于南京生物医药研究院。血脉通颗粒为我院自制剂，主要成分为制首乌、水蛭、制黄精等7味中药，制成颗粒配方约35 g(相当于生药100 g)。RNA提取试剂(Trizol)购自Invitrogen公司，逆转录试剂盒(RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit)购自Fermentas公司，引物由上海生工公司合成，荧光定量PCR试剂盒(SYBR Green qPCR Master Mix)购自Roche公司，IL-6和 TNF-α试剂盒购自 R＆D公司，流式所用相关抗体、FACS Calibur流式细胞仪均购自美国BD公司，实时定量PCR仪购自美国ABI公司。

1．2 方法

1．2．1 造模与分组处理 将小鼠正常饲料适应性喂养1周后，饲以含脂肪21%、胆固醇0．15%的高脂饲料(60Co-γ射线辐照灭菌处理)，饲养条件为2级，室温保持22～24℃，相对湿度50%，光照时间7:00 am～19:00 pm。小鼠高脂喂养13周后，随机处死2只，分离胸主动脉进行油红O染色(插页Ⅰ图3)，斑块明显可见，证实造模成功。将剩余22只小鼠随机分为血脉通组和对照组，每组11只。血脉通组给予血脉通颗粒 3．808 mg/(g·d)［7］灌胃，对照组给予等量生理盐水灌胃。

1．2．2 TLR4 mRNA检测 采用RT-PCR法。将小鼠连续喂药6周后处死，眼眶静脉丛采血。分离外周血单核细胞，用 Trizol试剂提取总 RNA，溶于DEPC水中;紫外分光光度计测定OD260/OD280的比

1．2．3 TLR4荧光强度检测 采用流式细胞术。取EDTA-K2抗凝的全血100μL，加入 CD11b-FITC和TLR4-PE单克隆抗体，震荡混匀后避光孵育20 min;加入免洗溶血素，震荡混匀10 min;加入PBS缓冲液500μL，混匀后上机检测。结果分析应用Cell Quest软件，根据前向散射光和侧向散射光圈定单核细胞群，分析CD+11b/TLR4+细胞群，并计算平均荧光强度。

1．2．4 血浆IL-6、TNF-α 检测 采用ELISA法检测血浆IL-6和TNF-α水平，严格按照试剂盒说明书操作。450 nm读取吸光度(A)值，以标准品浓度为横坐标，A值为纵坐标，计算出标准曲线的回归方程，将样本的A值带入方程式，计算出样本浓度。

1．2．5 统计学方法 采用SPSS17．0统计软件。计量资料以¯x±s表示，组间比较采用t检验，相关性采用Pearson相关分析。P≤0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 两组外周血单核细胞TLR4 mRNA表达比较

血脉通组和对照组单核细胞TLR4 mRNA相对表达量分别为 0．22 ±0．07、0．31 ±0．09，P ＜0．05。

2．2 两组外周血单核细胞表面TLR4荧光强度比较 血脉通组和对照组单核细胞表面TLR4荧光强度分别为25．45 ±8．30、34．04 ±7．30，P ＜0．05。

2．3 两组血浆IL-6和TNF-α水平比较 血脉通组血浆IL-6和 TNF-α 水平分别为(10．86±4．41)、(36．94 ±9．46)pg/mL，对照组分别为(18．24 ±8．21)、(52．82 ± 13．78)pg/mL;两组比较，P 均＜0．05。

2．4 IL-6、TNF-α 水平与单核细胞表面 TLR4荧光值在1．8 ～2．0，计算RNA 浓度。取总RNA 2 μL，逆转录合成cDNA。TLR4上游引物:5'-CACTGTTCTTCTCCTGCCTGAC-3'，下游引物:5'-TGGTTGAAGAAGGAATGTCATC-3'，扩增长度:196 bp。GAPDH 上游引物:5'-TGCCCCCATGTTTGTGAT-3'，下游引物:5'-GTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3'，扩增长度:244 bp。PCR反应体系:SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，cDNA 1 μL，加灭菌双蒸水至20μL。PCR反应条件:95℃预变性5 min，95 ℃ 20 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 20 s(45 个循环)，循环后设置55～90℃，每隔0．3℃读荧光值生成熔解曲线。每个样本重复测定3次，以GAPDH为内参，实验结果采用相对定量法，计算各样本ΔCt值(目的基因Ct值－内参基因Ct值)，各样本目的基因相对定量以2－ΔCt表示。强度的关系 小鼠血浆IL-6、TNF-α的水平与单核细胞表面TLR4荧光强度均呈正相关(r=4．86、0．51，P 均 ＜0．05)。

3 讨论

TLR是一类重要的模式识别受体，特别是TLR4，作为新的炎症信号传递门户蛋白，能够识别特定类型微生物的保守分子成分，从而激活信号转导途径，诱导炎症反应;还可以促进抗原递呈细胞的活化，启动固有免疫反应，抵抗微生物感染。TLR4是免疫反应、慢性炎症和脂代谢紊乱间的桥梁，激活TLR4可引起慢性炎症反应，参与AS的形成［1］。

研究发现，TLR4的下游信号通路中存在一个重要的转录因子 NF-κB［8］。静息状态下，NF-κB 存在于胞质中，以一种无活性的形式与其抑制性蛋白IκB结合。在脂多糖(LPS)刺激下，IκB被磷酸化并降解，NF-κB也由胞质转移至胞核，继而启动一系列炎症相关基因的转录。LPS通过TLR4激活NF-κB，上调黏附分子ICAM-1、VCAM-1、内皮细胞白细胞黏附分子的表达［9］。TLR4激活能够增加单核细胞趋动蛋白1(MCP-1)和其他趋化因子表达，从而参与单核细胞聚集并启动炎症反应［1］。Yu等［10］研究发现，单核/巨噬细胞泡沫化过程中通过激活mTOR信号途径上调 TLR4表达，抑制 ox-LDL诱导的mTOR激活，可降低单核/巨噬细胞TLR4的表达，并减少泡沫细胞的形成。此外，TLR4激活还能诱导单核/巨噬细胞分泌基质金属蛋白酶2、9和组织蛋白酶表达增加，参与细胞外基质的降解［11］。Xie等［12］发现，急性冠脉综合征患者外周血TNF-α、MMP-9以及单核细胞表面TLR4的表达水平显著高于对照组，可作为冠状动脉粥样硬化疾病易损斑块的有效预警指标。

本研究结果显示，血脉通颗粒治疗后，AS小鼠外周血单核细胞TLR4的表达水平显著低于对照组，差异有统计学意义;而且治疗后血浆 IL-6和TNF-α水平显著下降，与单核细胞表面TLR4荧光强度呈正相关。TLR4主要表达于单核/巨噬细胞表面，而单核/巨噬细胞是AS斑块的主要构成细胞。单核/巨噬细胞可通过TLR4信号通路分泌多种炎症因子(如 IL-6、TNF-α)，加重炎症反应。同时，炎症因子IL-6和TNF-α又可促进巨噬细胞表面LDL受体的合成及巨噬细胞对LDL摄取，加速脂质的沉积，促进粥样斑块的形成［13］。

综上所述，血脉通颗粒可降低AS小鼠外周血单核细胞TLR4的表达并减少炎症因子IL-6和TNF-α的分泌，很可能是其治疗AS的机理之一。

［1］Li H，Sun B．Toll-like receptor 4 in atherosclerosis［J］．JCell Mol Med，2007，11(1):88-95．

［2］Liu R，He Y，Li B，et al．Tenascin-C produced by oxidized LDL-stimulated macrophages increases foam cell formation through Tolllike receptor-4［J］．Mol Cells，2012，34(1):35-41．

［3］Lu Z，Li Y，Jin J，et al．Toll-like receptor 4 activation in microvascular endothelial cells triggers a robust inflammatory response and cross talk with mononuclear cells via interleukin-6［J］．Arterioscler Thromb Vasc Biol，2012，32(7):1696-1706．

［4］Scholtes VP，Versteeg D，de Vries JP，et al．Toll-like receptor 2 and 4 stimulation elicits an enhanced inflammatory response in human obese patients with atherosclerosis［J］．Clin Sci(Lond)，2011，121(5):205-214．

［5］张琪，张斌霞，蒋晓霞，等．血脉通颗粒治疗颈动脉粥样硬化的临床研究［J］．南京中医药大学学报，2006，22(3):162-164．

［6］张斌霞，曾晓辉，张亦民．血脉通颗粒对颈动脉粥样硬化的实验研究［J］．陕西中医，2007，28(9):1254-1256．

［7］徐叔云．药理试验方法学［M］．北京:人民卫生出版社，2002:200．

［8］Kawai T，Akira S．Signaling to NF-kappaB by Toll-like receptors［J］．Trends Mol Med，2007，13(11):460-469．

［9］Yang J，Huang C，Yang J，et al．Statins attenuate high mobility group box-1 protein induced vascular endothelial activation:a key role for TLR4/NF-κB signaling pathway［J］．Mol Cell Biochem，2010，345(1-2):189-195．

［10］Yu M，Kang X，Xue H，et al．Toll-like receptor 4 is up-regulated by mTOR activation during THP-1 macrophage foam cells formation［J］．Acta Biochim Biophys Sin，2011，43(12):940-947．

［11］Paolillo R，Iovene MR，Romano Carratelli C，et al．Induction of VEGF and MMP-9 expression by toll-like receptor 2/4 in human endothelial cells infected with Chlamydia pneumoniae［J］．Int J Immunopathol Pharmacol，2012，25(2):377-386．

［12］Xie P，Cao YS，Su P，et al．Expression of toll-like receptor 4，tumor necrosis factor-alpha，matrix metalloproteinase-9 and effects of benazepril in patients with acute coronary syndromes［J］．Clin Med Insights Cardiol，2010，11(4):89-93．

［13］Gustafson B．Adipose tissue，inflammation and atherosclerosis［J］．JAtheroscler Thromb，2010，17(4):332-341．