清热解毒中药对心肌细胞缺氧复氧损伤影响的实验研究

朱祖成

湖北民族学院医学院，湖北 恩施 445000

心肌缺血，是冠心病的一种重要病理环节［1］。目前，国内外学者多认为炎症细胞浸润、脂质过氧化损伤、冠脉内皮功能障碍、血管平滑肌迁移与增殖、血小板聚集等因素都是冠心病炎症反应的始动因素，炎症贯穿了冠心病发生发展的全过程［2－3］。

清热解毒中药不仅具有清热解毒的功效，同时还具有疗虚、通络等功效;并且现代药理研究表明［4－5］，清热解毒中药大多具有抗炎作用，能抑制炎症介质的合成和释放，具有抗脂质过氧化损伤及抗血管平滑肌增殖的作用。清热解毒中药可通过降血脂、拮抗内皮素、抑制平滑肌细胞增殖和抑制血小板聚集以达到抗炎的目的。

本文选择临床常用的清热解毒类中药黄连、穿心莲、栀子3味中药，进行中药对体外培养心肌细胞缺血再灌注样损伤影响的药效学实验研究，以找出清热解毒中药干预冠心病心肌缺血的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康SD大鼠，SPF级，雄性，体重:250～300g，150只，北京大学医学部实验动物科学部提供(SCXK(京)2006－0008)。

1.2 实验试剂 黄连、穿心莲、栀子的提取物 (郑州颖河生物科技有限公司);盐酸地尔硫卓片 (天津田边制药有限公司);LDH、SOD、MDA、NO、NOS、IL－6、TNF－α试剂盒 (中生北控生物科技股份有限公司);DMEM干粉、胰蛋白酶、胶原酶Ⅱ、胎牛血清 (Hyclone);MTT、DMSO(美国Sigma)。

1.3 实验方法

1.3.1 中药含药血清的制备［6］中药含药血清按通法制备:健康SD大鼠，每天灌胃给药2次，早晚各1次，(即一天的剂量分2次服用)，连续3d(第4 d一次服用全天剂量)，末次给药后1h戊巴比妥钠麻醉大鼠，腹主动脉取血，不抗凝，室温静置30min;待凝血坚固、血清析出后室温、3000rpm，离心10min，上清液即为含药血清。同组含药血清混合均匀，56℃、水浴灭活30min，0.22μm微孔滤膜过滤、除菌，EP管分装，－20℃低温冰箱中冻存，备用。

1.3.2 心肌细胞的原代培养［7］1～3日龄的大鼠乳鼠，无菌条件下脱颈椎处死，取心尖部组织，将其剪成约1mm3大小碎块，适量0.125%胰酶及0.05%Ⅱ型胶原酶消化，37℃恒温水浴振荡器中消化1 h(0.5 h时取出吹打一次)，20%胎牛血清的DMEM培养基终止消化，200目孔径不锈钢网筛过滤，细胞悬液900rpm·min－1，离心10 min，弃上清消化液PBS缓冲液冲洗细胞沉淀，连续3次;20%(体积分数)胎牛血清、100万U双抗 (青链霉素)的DMEM培养基将细胞沉淀混匀，37℃、5%CO2培养箱中差速贴壁分离1.5 h，得到纯化的心肌细胞。调整细胞浓度6×105个·m l－1，接种于铺有1%明胶的培养板中。放入5%CO2培养箱中继续培养，48h后换液。培养3d后选择生长良好，搏动规律的心肌细胞用于实验。

1.3.3 心肌细胞缺氧复氧模型的复制［8］及分组 本实验反应体系中含药血清加入浓度为10%(体积分数)浓度的中药含药血清。本实验设6个实验组:即正常对照组、模型组、盐酸地尔硫卓组、黄连组、穿心莲组、栀子组。

正常对照组:取培养于6孔板的心肌细胞，洗弃旧培养基，换成含1%葡萄糖的D－hanks台式液 (D－hanks液(g/L):NaCl 8.0，KCl 0.4，NaHPO4·H2O 0.06，KH2PO40.06，NaHCO30.35，酚红 0.02)，1ml/孔，5%CO2培养箱中培养1.5h后取出换为含10%SD大鼠空白血清的DMEM培养基继续培养2h。

模型组:洗弃旧培养基，换成氮气 (N2)饱和的无糖D－hanks液 (500μl/孔)，置自制密闭盒中持续通以95%N2+5%CO2混合气30min，充分排净盒中残余的氧气，放入5%CO2培养箱中培养1.5h后，取出换为含10%空白血清DMEM培养基继续培养2h，作复氧处理。

给药组:洗弃旧培养基，每孔加入相应体积 (即50μl)SD大鼠的不同中药血清，N2饱和的无糖D－hanks液补足体积 (500μl)，使整个体系的中药含药血清浓度为10%(体积分数)，置自制密闭盒中持续通以95%N2+5%CO2混合气30min，充分排净盒中残余的氧气，放入5%CO2培养箱中培养1.5h，作缺氧处理，吸弃细胞上清液。再加入相应体积 (即50μl)SD大鼠的不同中药血清，10%胎牛血清DMEM培养基补足体积 (500μl)，5%CO2培养箱中继续培养2h，作复氧处理，取细胞上清液，测定各生化指标的含量或活力。

1.3.4 MTT法检测心肌细胞相对活力 另取生长于96孔板上的心肌细胞，板周边的孔不加细胞，防止有边缘效应。PBS缓冲液冲洗细胞2次，(留空白孔调零，以只加培养液不加细胞作空白对照)分别加入10%(体积分数)浓度空白血清或不同药物血清的DMEM培养基100μl。每组设8个复孔，37℃、5%CO2培养箱中继续培养24h后，PBS冲洗2次，加入MTT 100μl/孔 (PBS配制，0.22μm滤器过滤除菌)，37℃、5%CO2培养箱孵育4h，弃MTT液，每孔加入200μl纯DMSO裂解细胞，震荡10min使MTT蓝紫色结晶完全溶解，用RT－6000酶标仪于490nm波长处测定各孔吸光度 (OD)值。每孔OD值减去空白孔OD值为测试孔OD真实值，活细胞数与OD值成正比。

1.3.5 上清液中细胞缺氧复氧损伤观察指标的检测 取缺氧复氧心肌细胞培养液，按照TNF－α、IL－6 ELISA试剂盒说明书要求操作，使用Rayto酶标仪测定培养液中TNF－α、IL－6水平;按照NO、NOS、SOD、MDA试剂盒说明书要求操作，使用半自动生化分析仪，分别测定培养液中SOD、NOS活力，MDA、NOS含量;按照LDH试剂盒说明书要求操作，使用半自动生化分析仪，测定培养液中LDH活力。

1.4 统计学分析 实验数据均采用平均值±标准差 (x±s)表示，SPSS13.0统计软件作One－Way ANOVA分析。

2 结果

2.1 清热解毒中药血清对缺氧复氧损伤心肌细胞LDH、SOD、MDA释放量的影响 与正常对照组比较，缺氧复氧模型组细胞培养液中LDH、MDA释放量显著升高，SOD活性显著降低，差异有统计学意义 (P＜0.01);与模型组比较，黄连、穿心莲组培养液中LDH、MDA释放量显著降低，SOD活性升高 (P＜0.01或P＜0.05)，栀子组培养液中LDH释放量降低 (P＜0.01)。结果见表1。

表1 清热解毒中药血清对缺氧复氧心肌细胞LDH、SOD和MDA释放量影响 (n=5，±s)

表1 清热解毒中药血清对缺氧复氧心肌细胞LDH、SOD和MDA释放量影响 (n=5，±s)

注:与正常对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01;与模型组比较，※P＜0.05，※※P＜0.01。

组别 剂量/mg·kg－1·d－1 LDH 活力/U·L－1 SOD 活力/U·ml－1 MDA含量/nmol·ml －1 102.46±3.51 85.67±5.29 3.46±0.34模型组 － 434.23±27.75△△ 56.84±5.44△△ 6.48±0.53△△盐酸地尔硫卓组 37.8 332.58±27.28△△※※ 67.25±4.25△△※※ 5.61±0.65△△※※黄连组 122.54 388.71±32.51△△※※ 68.82±4.49△△※※ 5.72±0.48△△※※穿心莲组 191.84 407.42±20.85△△※ 67.08±4.71△△※※ 5.87±0.46△△※栀子组 559.44 386.01±21.60△△※※正常对照组 －57.85±4.24 6.37±0.48

2.2 清热解毒中药血清对缺氧复氧心肌细胞TNF－α、IL－6释放水平的影响 与正常对照组比较，缺氧复氧模型细胞培养液中TNF－α、IL－6水平显著升高，差异有统计学意义 (P＜0.01);与模型组比较，黄连、穿心莲组细胞培养液中TNF－α、IL－6水平显著降低，栀子组培养液中IL－6水平降低，差异有统计学意义 (P＜0.05或 P＜0.01)。结果见表2。

表2 清热解毒中药血清对缺氧复氧心肌细胞TNF－α、IL－6释放水平影响 (n=5，s)

表2 清热解毒中药血清对缺氧复氧心肌细胞TNF－α、IL－6释放水平影响 (n=5，s)

注:与正常对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01;与模型组比较，※P＜0.05，※※P＜0.01。

组别 剂量/mg·kg－1·d－1 TNF － α/pg·ml－1 IL －6/pg·ml －1 257.55±13.63 85.91±7.30模型组 － 708.00±44.49△△ 178.99±7.73△△盐酸地尔硫卓组 37.8 682.36±35.62 175.58±7.88黄连组 122.54 565.54±33.13△△※※ 134.99±16.22△△※※穿心莲组 191.84 586.41±31.10△△※※ 161.54±3.64△△※※栀子组 559.44 690.41±44.10 169.04±6.70正常对照组 －△△※

2.3 清热解毒中药血清对缺氧复氧心肌细胞NO、NOS释放水平的影响 与正常对照组比较，缺氧复氧模型细胞培养液中NO含量、NOS活力显著升高，差异有统计学意义 (P＜0.01);与模型组比较，黄连、穿心莲组细胞培养液中NO含量显著降低，黄连组细胞培养液中NOS活力显著降低，差异有统计学意义 (P＜0.01或P＜0.05)。结果见图1、2。

3 讨论

正常情况下，TNF－α在心肌细胞中没有表达，但当外环境发生改变时也可分泌TNF－α，并与自身的TNF－α受体结合产生有害的生物学效应［9］。结果提示，心肌细胞缺氧复氧损伤培养液中炎症因子TNF－α、IL－6水平均显著性升高;黄连、穿心莲能显著抑制缺氧复氧损伤心肌细胞分泌炎性因子TNF－α、IL－6，栀子能显著抑制缺氧复氧损伤心肌细胞分泌炎性因子IL－6，对心肌细胞具有防护作用。

NO和NOS在心肌缺血再灌注损伤 (MIRI)中起着极其重要的作用。产生于心肌细胞的诱生型iNOS催化分泌NO立即与氧反应生成氧自由基，并且NO亦可直接作用于心肌细胞，可认为是一种自分泌方式，对心肌具有毒性作用［10］。结果显示，缺氧复氧损伤心肌细胞培养液中NO含量与NOS活力更加急剧升高，进一步加深心肌细胞的氧化损伤。黄连、穿心莲能显著减弱NOS活力，减少NO的形成释放，保护缺氧复氧损伤心肌细胞。

研究显示［11－12］，心肌缺血－再灌注后很短时间内，心肌组织内氧自由基爆发式产生，与心肌细胞膜上的多价不饱和脂肪酸发生连锁反应，从而导致细胞 (器)膜流动性显著降低，通透性显著升高，蛋白功能异常，线粒体肿胀乃至崩解以及DNA断裂等，最终细胞出现坏死或凋亡，进一步加深缺血心肌不可逆损伤。结果显示，清热解毒中药能改善缺氧复氧损伤心肌细胞中LDH的漏出率，提高SOD活力，减少MDA含量。

本实验通过血清药理学实验方法的运用，可以得出结果，清热解毒中药通过降低缺氧复氧损伤心肌细胞分泌炎性因子TNF－α、IL－6;降低NO对心肌细胞的毒性作用，升高SOD活力，抑制脂质过氧化损伤，降低LDH活性等作用保护缺氧复氧损伤心肌细胞。

［1］ BeckerL B．New concepts in reactive oxygen species and cardiovascular reperfusion physiology ［J］．Cardiovasc Res，2004;61(3):461 －473．

［2］陈冰雪，刘莉，鲍军强，等．细胞因子对冠心病发生、发展的作用及影响［J］．白求恩军医学院学报，2009，12;7(6):376－377．

［3］张赛男，黄萍，邬左莉，等．清热解毒治疗冠心病机理探讨［J］．浙江中医杂志，2007;42(4):194－195．

［4］沈自尹．清热解毒药对感染性炎症作用原理的新认识［J］．中国中西医结合杂志，1997，10;17(10):628－629．

［5］范文昌，梅全喜，欧秀华，等．12种广东地产清热解毒药材抗炎作用的研究［J］．中国药材，2011，20(8)，28－29．

［6］韩林，贾波，石含秀，等．中药血清药理学研究探讨与思考［J］．中西医结合杂志，2009，19(5):319－321．

［7］伍长学，范英，李新，等．新生大鼠心肌细胞原代培养方法的改进［J］．泸州医学院学报，2009，32(1):1－4．

［8］Amer Talbi Yong jie Zhang Xijing Chen，etal．心肌细胞缺氧/复氧损伤模型研究与应用进展［J］．内蒙古中医药，2011，30(12):137－138．

［9］曾琳琳，张晓刚，胡波．高浓度葡萄糖对乳鼠心肌细胞肿瘤坏死因子－α基因表达的影响［J］．国际心血管杂志，2009，9;36(5):300－304．

［10］王超，常小荣．NO、NOS在心肌缺血再灌注损伤中的作用及中药针灸治疗的概况［J］．湖南中医药导报，2002，12;8(12):738－741．

［11］ Chuan Yu Li，RobertM．Jackson．Reactive speciesmechanisms of cellular hypoxia reoxygenation injury ［J］．Am J Physiol Cell Ph，2002，282:C227－230．

［12］ Nandor，Marczin，Nihal El－ Habashi，Ginette S．Hoare，etal．Antioxidants in myocardial ischemia－reperfusion injury:therapeutic potential and basic mechanisms［J］．Arch Biochem Biophys，2003，420:222 －225．