2(5H)-吡咯酮衍生物的合成及对铜绿假单胞菌生物膜的体外作用

郭嘉亮， 刘兆祥， 巢 伟， 孙平华

(暨南大学药学院，广东 广州 510632)

上世纪末，科学家证实细菌之间存在着信息交流(cell-cell signaling or intercellular communication)，细菌能通过信息分子的浓度来感知其数量，从而诱发一些从量变到质变的生理过程，如毒性基因的表达，细菌的群游和生物膜 (biofilms，BF)的形成等等，细菌之间的这种“语言”被科学家Fuqua称为群体感应 (quorum sensing，QS)［1］.革兰氏阴性菌的群体效应一般都是由LuxR/I型群体感应系统调控，并以酰基高丝氨酸内酯类分子(acyl-homoserine lactone，AHL)作为自诱导剂 (autoinducer，AI)［2］.目前，一些呋喃以及呋喃酮类化合物 (Furanones)被证实了具有良好的群感效应的拮抗作用，可以有效抑制生物膜的形成［3］.研究揭示抗生素耐药问题与致病菌在人体内以生物膜的方式生长密切相关［4］，而且超过80%的微生物感染由细菌的生物被膜引起，如何干扰病原菌的QS系统来减弱动植物病原细菌的致病性已成为当下研究的热点［5］.

呋喃与吡咯无论大小、形状都相似，两者互为生物电子等排体，而且五元含氮杂环化合物由于具有广泛的生物活性而备受重视，故吡咯酮可能是比呋喃酮更有潜力的群体感应抑制剂的先导化合物.目前国内未见吡咯酮作为QS抑制剂在该领域中的应用，国外的相关研究和报道也非常少，仅限于吡咯二酮类化合物［6］.因此，本实验创新性通过设计合成系列2(5H)-吡咯酮类目标化合物(反应流程见图1、2)，并且观察形态学上它们对生物被膜结构的破坏及清除作用，初步实验表明，溴代2(5H)-吡咯酮对革兰氏阴性菌PA的生物膜形成具有明显抑制作用.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

X-6型显微熔点仪;Bruker-AV300/400 MHz型核磁共振仪;PE CHNS/O EA2400Ⅱ型元素分析仪;Thermo Finnigan LCQ adwantage型质谱仪.TLC采用硅胶HF254，柱层析采用100～200目硅胶(青岛海洋化工厂).所用试剂均为分析纯.铜绿假单胞菌(由暨南大学附属第一医院惠赠)，SW-CJ-1F型单人双面净化工作台(苏州净化设备厂);热场发射扫描电镜SEM(Hitachi S-3000N)，聚氯乙烯吸痰管(上海上医康鸽医用器材有限公司);戊二醛 (Sigma);LB液体培养基:蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L和NaCl 10 g/L，MHB液体培养基:马-欣二氏基质21 g/L;生理盐水:质量分数0.9%NaCl.以上培养基都经过121℃高压灭菌备用.

1.2 合成部分［7］

(1)化合物 2a:将化合物 1a(60.3 g，0.46 mol)和200 mL HOAc混合置于500 mL三口圆底烧瓶中，一边搅拌，一边在冰浴下滴加 (49.2 g，0.53 mol)NaNO2和60 mL去离子水所配成的溶液，控制滴加速度使反应温度维持在8～12℃.滴加完毕后温热至室温，静置过夜.得到橙红色油状液体2a.TLC 检测呈一个单点 (VEtOAc∶Vpetroleumether=1∶2)，Rf值约为 0.4.1H NMR(CDCl3/TMS，400 MHz):δ 1.33(t，3H，J=7.5Hz)，2.05(s，3H)，2.39(s，3H)，4.35(q，2H，J=7.5Hz)，9.77(s，1H，NH).同样方法得到2b，2c.

(2)化合物4a:向化合物2中加入乙酰丙酮(52.2 g，0.52 mol)，剧烈搅拌下分批加入 Zn 粉(67.5 g，1.03 mol)，冰浴控制反应温度 50 ～60℃.加完后将混合物搅拌2 h，加热回流24 h，趁热将反应物倾倒入水中，冷却析出固体，体积分数95%EtOH重结晶，真空干燥，得纯白色晶体4a(76.5 g，80%)，mp.143 ～ 145 ℃.1H NMR(CDCl3/TMS，400 MHz):δ 1.38(t，3H，J=7.5 Hz)，2.45(s，3H)，2.53(s，3H)，2.59(s，3H)，4.35(q，2H，J=7.5 Hz)，9.34(brs，1H，NH).同样方法得到 4b，4c.4b:白色晶体，1H NMR(CDCl3/TMS，300 MHz):δ 1.34(t，3H，J=7.5 Hz)，2.24(s，3H)，2.30(s，3H)，4.38(q，2H，J=7.5 Hz)，5.76(s，1H)，9.02(brs，1H，NH).4c:淡黄色晶体，1H NMR(CDCl3/TMS，400 MHz):δ 2.24(s，3H)，2.30(s，3H)，3.82(s，3H)，5.79(s，1H)，8.75(s，1H，NH).

(3)化合物5a:配有搅拌子和导气管的500 mL三口圆底烧瓶中加入300 mL乙二醇，鼓入N2，剧烈搅拌下依次加入化合物4a(76.5 g，0.38 mol)和80%的水合肼 (25 g，0.5 mol)，在油浴下 (120℃)加热至沸腾，回流2 h，改成蒸馏装置除去水分，冷却至室温后，加入 KOH(64 g，0.12 mol)，改成回流装置并回流3 h.然后一边反应一边收集105～160 ℃ /760 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)的馏分，少量水洗，3×45 mL体积无水Et2O萃取，无水Mg-SO4干燥，旋转蒸发除去Et2O后进行柱色谱分离，得到黏稠黄色液体 5a(38 g，84%).1H NMR(CDCl3/TMS，400 MHz):δ 1.09(t，3H，J=7.2Hz)，2.03(s，3H)，2.13(s，3H)，2.36(q，2H，J=7.2 Hz)，6.34(s，1H)，7.41(s，NH).

(4)化合物6a:化合物5a(38 g，0.31 mol)放入配有搅拌子、温度计和导气管的500 mL三口圆底烧瓶中，鼓入 N2，剧烈搅拌下依次加入100 mL MeOH，40 mL H2O，升温至50℃，搅拌片刻后，在冷凝管上放置滴液漏斗，分次滴加20.5 mL体积分数 30%H2O2(38 mL，11.40 g，0.34 mol)控制温度不超过60℃，滴加完毕后在50℃下搅拌3 h，再回流2 h，并冷却至室温.加入8 g K2CO3和18 mL H2O所配成的溶液，搅拌过夜.然后加入100 mL H2O洗，再用CH2Cl2萃取至无色，水层用浓HCl调pH值至中性，再继续进行萃取，合并有机层，用饱和食盐水洗，无水MgSO4干燥，旋转蒸发得到黄棕色油状物6a，TLC 检测 (VEtOAc∶Vpetroleumether=2∶1)，Rf值为 0.65.1H NMR(CDCl3/TMS，400 MHz):δ 0.99(t，3H，J=7.5 Hz)，1.15(d，3H，J=6.8 Hz)，1.67(s，3H)，2.09(q，2H，J=7.4 Hz)，3.95(q，1H，J=6.8 Hz)，7.72(s，NH);MS(ESI)m/z 140.2［M+H］+.6b:白色固体，1H NMR(CDCl3/TMS，400 MHz):δ 1.27(d，3H，J=7.5 Hz)，1.88(s，3H)，4.13(q，1H，J=7.5 Hz)，6.40(s，1H，NH)，6.64(s，1H);MS(ESI)m/z 112.2［M+H］+.

(5)化合物7a:配有温度计和导气管的三口圆底烧瓶中加入化合物6a(13.5 g，97 mmol)和无水EtOAc(150 mL)，鼓入N2，搅拌10 min，缓慢滴加Br2(31 g，20 mmol)，控制温度不超过55℃.然后回流15 min，冷却至室温.EtOAc层先后用质量分数为5%(3×30 mL)及10%(3×30 mL)NaHCO3进行洗涤.棕色沉淀析出在分液漏斗里，将其过滤并以H2O和冷EtOAc洗涤.合并EtOAc部分，H2O(3×10 mL)和饱和食盐水 (20 mL)洗涤，无水Mg-SO4干燥.旋干溶剂，得红棕色油状物，柱色谱分离得到浅黄色固体7a(8 g，45%).1H NMR(CDCl3/TMS，400 MHz):δ 1.16(t，3H，J=7.5 Hz)，1.86(s，3H)，2.40(q，2H，J=7.5 Hz)，5.91(s，1H)，7.52(s，NH);MS(ESI)m/z 216.2 and 218.2［M+H］+.同样方法得到7b:白色固体 (15 g，60%)，TLC 检测 (VEtOAc∶Vpetroleumether=1∶2)，Rf值为 0.65.1H NMR(CDCl3/TMS，300 MHz):δ 1.15(t，3H，J=7.5 Hz)，1.84(s，3H)，2.73(q，2H，J=7.5 Hz)，7.33(s，NH);13C NMR(CDCl3/TMS，300 MHz)δ 9.11，14.05，20.01，74.26， 133.78， 140.02， 146.24， 170.27;MS(ESI)m/z 296.4 ［M+H］+;Anal.Calcd for Found:(C8H9Br2NO)C:32.57%;H:3.08%;N:4.75%;S:0%);Found:C，31.73%;H，2.70%;N，4.56%;S，0%.

(6)化合物8:黄棕色固体，空气中不稳定，TLC检测呈一个单点 (VEtOAc∶Vpetroleumether=1∶3)，Rf值为 0.60.MS(ESI)m/z 184.2 and 186.2［M+H］+.

(7)化合物 9:化合物4a(10.43 g，0.71 mol)溶于100 mL无水EtOH 中，加入11.42 g Zn粉，强烈搅拌，N2保护下快速滴加70 mL浓HCl，使反应温度达到60℃，并维持至Zn粉消耗完全，将反应物倾倒入200 g碎冰中，析出粗产品，过滤，体积分数 95% EtOH 重结晶，得白色晶体 (5.15g，52.9%).1H NMR(CDCl3/TMS，400 MHz):δ 1.04(t，3H，J=7.5 Hz)，1.34(t，3H，J=6.8 Hz)，2.20(s，3H)，2.27(s，3H)，2.38(q，2H，J=6.8 Hz)，4.29(q，2H，J=7.5 Hz)，8.66(s，NH).

(8)化合物 10a:将化合物 4(10.43 g，0.71 mol)，NaOH 40 g，体积分数95%EtOH 80 mL，H2O 10 mL充分混合置于250 mL三口圆底烧瓶中，回流4 h，旋蒸去掉EtOH，并室温冷却.一边剧烈搅拌，一边滴加稀释的盐酸，调节pH值少于1，固体析出，抽虑去除溶剂，真空干燥过夜，得到紫色固体(5 g，62.3%).1H NMR(DMSO，400 MHz):δ 2.38(s，3H)，2.48(s，3H)，2.50(s，3H)，11.68(s，NH)，12.38(s，NH).10b:紫色固体，1H NMR(CDCl3/TMS，300 MHz):δ 2.26(s，3H)，2.34(s，3H)，5.84(s，1H)，8.87(s，1H，NH)，11.0(s，1H);MS(ESI)m/z 140.07［M+H］+.

(9)化合物11:在溶有10 g化合物10a的100 mL MeOH中，加入10 mL H2O，强烈搅拌，在N2保护下回流24 h，过滤，用CHCl3萃取，旋转蒸发去掉溶剂，得到红棕色油状物，进行柱色谱分离纯化.得到紫色固体 (5.14 g，70%).1H NMR(CDCl3/TMS，300 MHz):δ2.29(s，3H)，2.40(s，3H)，2.50(s，3H)，6.42(s，1H)，8.45(s，NH);13C NMR(CDCl3/TMS，300 MHz)δ 14.20，15.69，31.25，115.61，121.02，121.17，136.80，196.52;MS(ESI)m/z 138.3 ［M+H］+;Anal.Calcd for Found:(C8H11NO)C:70.04%;H:8.08%;N:10.21%;S:0%);Found:C， 69.79%;H，8.08%;N，10.47%;S，0%.

(10)化合物 13a:将化合物 12a(0.36g，2 mmol)，醋酸铵 (0.77g，10 mmol)，10 mL HOAc混合，加热回流36 h，冷却到室温，EtOAc(3×100 mL)萃取，并加入饱和NaHCO3溶液直至无气泡产生为止，合并有机相，无水Na2SO4干燥、过滤，旋干溶剂，柱色谱分离 (VEtOAc∶Vpetroleumether=1∶10)，分别得到 13a(0.05 g，产率 56.0%).化合物 13a:1H NMR(CDCl3/TMS，300 MHz):δ 5.36(s，1H)，6.32(dd，J=1.5 Hz，5.7 Hz，1H)，7.00(dd，J=1.4 Hz，5.6 Hz，1H)，9.16(s，NH);MS(ESI)m/z 174［M+H］+;同样方法得到化合物13b:1H NMR(CDCl3/TMS，300 MHz):δ 5.30(s，1H)，7.12(s，1H)，9.00(s，NH);MS(ESI)m/z 251.8 and 253.7 ［M+H］+.1.3 扫描电镜实验［8］

将PA接种于LB培养基中，37℃恒温培养过夜，取菌液离心，无菌生理盐水洗涤2次，再用生理盐水配成0.5麦氏比浊标准 (细菌数约为5×108-9CFU/mL)的菌悬液.然后将菌悬液用生理盐水稀释50倍.将BF载体放入盛有5 mL菌悬液的试管内，37℃恒温培养，分别培养3、5、7 d，形成不同阶段下的BF.

另取试管将BF载体放入盛有5 mL菌悬液的试管内，37℃恒温培养，分别于第3、5、7天向其中加入样品和蒸馏水，继续37℃ 恒温培养20 h.

以上实验组别每隔两天更换一次培养基，加药时确保试管中药物浓度前后一致.附着BF的载体经灭菌生理盐水冲洗去掉浮游菌后用质量分数2.5%戊二醛固定，依次用体积分数50%、70%、80%、90% 酒精各脱水1次，然后用100%酒精脱水2次，醋酸异戊酯脱水2次，每次均为5 min，CO2冷冻干燥5 h.载体表面在真空条件下镀金粉，SEM观察，确认BF形成.

2 结果与讨论

2.1 Wolff-Kishner还原

化合物4的3位上的羰基还原得到所需的亚甲基.但由于吡咯类化合物遇酸容易聚合，因此无法使用克莱门森(Chemmensen)还原法.这里使用了Wolff-Kishner还原法，利用肼 (联氨)作为还原剂，其要点是以水合肼与醛酮等成腙，然后在高沸点水溶性溶剂(这里是乙二醇)中常压将腙分解为烃.与克莱门森还原法相比较，本法更为适合，具体优点有:①适合酸敏感而对碱稳定的醛酮的还原;②副产物少，产率良好，本系列化合物的产率均在70%以上;选择性还原羰基，碳碳双键不受影响，不会还原到吡咯上的双键，故非常适合此处应用.此外，水解产生的醛酮在强碱存在下被还原为醇，产生大量副产物.因而分解腙之前要除尽水，可以通过增加肼量抑制副反应发生.

2.2 扫描电镜观察结果

经过在LB液-吸痰管系统中进行培养，黏液型铜绿假单胞菌在培养第1天时开始黏附;培养3 d与5 d在吸痰管上铜绿假单胞菌的黏附和细菌外物质的堆积随着时间的延长而增多，肉眼观察，BF被染成黑褐色棉絮状，分布不均匀.培养5 d形成的成熟BF比培养3 d形成的早期 BF明显稠厚，7 d后的BF最为成熟.

通过在SEM下进行观察，空白对照组第3天形成早期BF(图1A，B)，第5天形成成熟的大片状生物被膜，细菌被浓稠的黏液样物质包裹(图1C).BF在载体表而呈片状分布，BF内细菌呈短杆状，菌体长短不一，彼此聚集成堆，周围有凹凸不平的浓厚黏液状物质紧密包绕，第7天生物被膜更加稠厚，呈菜花状的立体结构，细菌借助这些浓厚的黏液状物质连接成大片BF，大部分细菌都被包裹在被膜层中(图1D).成熟BF的结构较早期BF致密.

图1 载体在PA悬液中培养3～7 dFig.1 Carriers being cultivated for 3 d-7 d in PA suspending

分别加入各种药物进行作用，发现加入药物7a，8a，8b等的试管明显不如空白组和其他组混浊，在载体周围的BF也明显少于空白组，黑褐色棉絮状也很少.在SEM下观察发现，被这几个药物处理的样品，在BF载体表面观察到有少量BF包裹的细菌群体，菌体清晰可见，细菌形态保持短杆状，但菌体间纤维样黏液物质显著减少(图2 A).尤其是对培养3 d时间的初期生物膜，溴代吡咯酮7a，8a，8b都能明显破坏BF的结构.

具体以7a对初期BF的作用为例:在细菌培养3 d(形成初期BF)，加入7a并培养20 h，可见细菌轻微群聚，形成一个个小的菌落，菌丝之间存在少量黏液样物质，生物被膜很薄一层覆盖在上面，并未产生大片厚厚致密的结构(图2 B，C).从形态学上说明吡咯酮化合物7a对BF结构产生了明显的抑制和破坏作用.然而细菌培养5 d后，加入药物7a后BF只是变薄、结构疏松，受到的影响明显减少.说明在BF成熟后，即使是对BF有抑制作用的药物7a，8a，8b也很难渗透进入成熟BF层(图2 D).这可能是由于BF成熟后，形成具有协调性、功能性和高度结构性的膜状复合物，药物很难进入其中.

图2 载体在含7a的PA悬液中培养20 h的情况Fig.2 Carriers being cultivated for 20h PA suspending which contained 7a

实验表明吡咯酮类化合物均可能能破坏PA早期及成熟BF，在体外均能明显抑制PA在固体表面的黏附力.但是，一旦细菌生物膜生长成熟，即使有很强抑菌活性的药物也很难起到很好的效果，这体现了抗生素耐药的一个重要原因.另一方面，小分子吡咯和未经溴代的吡咯酮基本上没有抑菌活性，唯独溴代的吡咯酮却有着特殊的作用，尤其是7a，与大量报道的呋喃酮相比较，虽不能直接抑制革兰氏阴性菌PA，但能明显抑制PA的群聚，并抑制其BF形成，其确切的作用机理还有待更深入的研究，但很可能与溴原子的活性特点相关.

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