复肝口服液中大黄素含量的RP-HPLC法检测

李耀兴

（吉化集团公司总医院，吉林 吉林 132021）

复肝口服液中大黄素含量的RP-HPLC法检测

李耀兴

（吉化集团公司总医院，吉林 吉林 132021）

目的 探究复肝口服液中大黄素含量的检测办法——反相高效液相色谱法实验测试。方法 按照以下标准来进行本次试验，要求色谱柱为 TB-C18 （160mm×513mm，6μm），甲醇 -0.2% 磷酸（80 ∶ 19），检测波长为 530nm，柱温为 40℃，流速为 2.0mL/S。结果 大黄素的样本标准容量为 0.08652-0.12570mg，在这个有限范围内的函数回归关系（r=0.8976），平均回收率为 99.36%，RSD=1.021%（n=6）。结论 本文介绍的检测办法简单易操作、快捷、效果良好，符合国家药品管理复肝口服液的质量标准。

大黄素含量；复肝口服液；反相高效液相色谱法

复肝口服液的主要药物成分是柴胡、当归、白芍、茯苓、白术、黄芪、枸杞子、女贞子、菟丝子、何首乌等名贵中草药，它的功效主要是抗病毒、提高人体免疫力、增强肝肾排毒功能、促进人体吸收消化[1]，在临床上主要用于治疗病毒性乙型肝炎和丙型肝炎。虎杖这一味药是复肝口服液的主要成分，而大黄素则是虎杖的重要活性组成部分，所以我们选取了大黄素作为检测复肝口服液是否合格的指标，用反相高效液相色谱（RP-HPLC）法检测定大黄素的成分及含量，这个方法方便、快捷、安全系数高，是值得信赖的好产品。

1 实验资料

为了保障实验的可靠程度高，收集的数据准确无误，我们在选用仪器设备上也要精益求精。本次实验仪器主要是1200型HPLC仪，包括G2170AB型PC化学工作站、G2311A型梯度泵、G2314A型紫外检测器；AX-200型电子天平；SQ250DD型数控超声波清洗器。试用药品是甲醇（色谱纯）和重蒸馏水，至于其他的试剂都必须是分析纯。所有的实验所需的物料都已经准备完善了，下面我们会详细介绍试验方法和步骤。

2 实验方法与结果

2.1 色谱标准

我们严格要求色谱柱TB-C18（160mm×513mm，6μm），甲醇-0.2%磷酸（80∶19），检测波长为530nm，柱温为40℃，流速为2.0mL/s。此时我们发现，在对照品的曲线图里大黄素与分色谱线呈现出交叉垂直，而大黄素与样品中的色谱基线相分离，出现两个高峰的位置，阴性对照在大黄素色谱峰位置处没有错峰出现，保持5min时间。

2.2 溶液试剂的准备

下面我们简单介绍一下对照品溶液的制作过程：首先取出对照品400mg大黄素，放在300mL的玻璃量杯中，加少量甲醇溶液，手动摇匀稀释对照品溶液至浓度为19.12μg/mL。

供试品溶液的制备：取出样品30mL，将其放在60mL圆底烧瓶中，加浓度为2.45mol/L的硫酸15mL，然后加适量的水让其过滤，滤液移入分液漏斗中，加三氯甲烷萃取20mL/次，一共萃取3次，最后把所有萃取液合拢回收，蒸干萃取液，把剩余的残渣加入甲醇溶解并转移到5mL量杯中，摇匀，用0.4μm的微孔过滤膜即得到试验品溶液。

紧接着我们把阴性对照溶液的制作方法做一下简单的了解：按照事先计算好的溶液比例和生产制作工艺制备不含虎杖的阴性样品溶液，必须采用专业的方式方法制备阴性对照溶液，大胆细心的分离出对照品溶液中的大黄素成分，并且按照色谱条件测定高峰面积，还要引用数学中的微积分，进行线性回归的假设，得出一个线性回归方程为Y=2321.16536X-3.3452 （r=0.198789）。计算结果表明，峰面积积分值的大小与大黄素样本容量在0.06785-0.37865mg的范围内的数学关系出现令人欣慰的线性关系。

精密度试验：我们吸取对照品溶液10μL，按照以上的色谱标准重复实验4次，测试后的峰面积的平均积分值为435.649，RSD=0.356%（n=5），这就说明仪器的精密度十分稳定，便于工作人员的操作。

稳定性试验：我们选择在第2、4、6、8、10h分别测试相同的一组供试品溶液，我们随机抽取了10μL样品溶液，测试结果中的峰面积平均积分值为398.358，RSD=0.98%，我们可以得出的结论是供试品溶液至少在这10h内的化学性质是十分自然和稳固的，不需要实验人员的额外关注。

重现性试验：我们选取同一批样品溶液，按照1∶1的比例进行试供品溶液的集体分发，在5份供试品溶液中我们按照色谱条件的标准来建立测试档案，结果显示为大黄素的平均含量为4.231mg/mL，RSD=0.99%，这说明了试样结果很符合之前的猜想。

加样回收率试验：取已知含量的样品30mL共5份，置于圆底烧瓶中，分别加入对照品溶液17.68μg/mL 4、5、6mL，我们把供试品溶液按上述色谱条件测定后的结论加以整合，得出的样回收率，具体结果可以见表1。

表1 样回收率试验结果（n=8）

样品含量检测：我们选择了3个不同生产批次的复肝口服液，每次随机抽取20mL，并且按照科学有效的方法制造供试品溶液，取15mL进入样本溶液，按照上文提到的方式-色谱条件标准法来监测出峰面积，然后根据既定的回归方程式计算出大黄素的真实含量，最终这3批样品的综合含量为5mg/mL（n=4）；RSD的值分别为0.13%、0.19%、0.23%。

3 讨 论

我们在探索酸水解精确时间时是这样做的：取4份样品溶液，每一份都是30mL，分别放置在50mL圆底烧杯中，然后再往烧杯里添加200mol/L的硫酸15mL，进行水浴回流1、2、3h，过滤后，将滤液用氯仿萃取4次，每次15mL，合并所有的萃取液，降低压力让其快速蒸发干净，最后添加4mL甲醇溶解和过滤，经过短暂的沉静，就可以用仪器检测出大黄素的实际含量。结论是酸水解时间分别为第1、2、3h时，对应的样品含量分别为3245、4067、4213mg/mL，这就说明酸水解1h即可[2]。在研究三氯甲烷需要多少萃取次数时，我们是这样尝试的取出样本溶液4份，每一份都是15mL，分别倒入60mL圆底烧瓶中，增加230mol/L的硫酸15mL，经过1h水浴回流后，过滤，滤液要经过氯仿萃取多次，每次15mL，然后将萃取液降低压力至完全脱水，加少量甲醇溶解，过滤，提取第4次时，对应的样品含量分别为4231、432、4150mg/mL，说明提取4次后就已经将大黄素完全提取出来了[3]。在试验中曾经采用不同长度的C18色谱柱比较分离效果，结果采用TB-C18分离效果是最好的，不仅等待的时间最短，而且大黄素的提取含量也是最高的。在可变波长紫外检测器上检测出了很多不同的数据，但是相对集中的数据是245、289、440、429nm这四个波长，在研究相对集中的波短下的样品图谱，结果最终选择430nm作为检测波长，不仅图谱的图形清晰明了，准确度也提高了许多。流动相中这二者的浮动比例进行多次筛选，我们决定选用甲酸-0.11%磷酸，因为在这个比例上大黄素与杂质的分离效果是比较接近实际的。

[1]国家 药典 委员会 编.中华人民 共和国药典 (一 部 )[S].北 京:化 学工业出版社,2005:附录331.

[2]郑凤 庚.反 相 高 效 液相色谱 法测定明 珠口服液中 大 黄 素 的 含 量[J].时珍国医国药,2001,12(5):3921.

[3]陈 娜 娜.高 效 液相色谱 法测定常通口服液中大 黄 素的含 量[J].中国药房,2003,14(5):2961.

R927.2

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：1671-8194（2013）10-0077-02