聚-DL-乳酸可吸收生物膜联合丹参注射液预防硬膜外粘连的实验研究

徐 聪，郭春钰，艾 雯，熊淑华，于雪峰，陈伟高

（1.南昌大学a.第四附属医院骨科，南昌 330002；b.第二附属医院药剂科；c.第二附属医院骨科，南昌 330006；2.赣南医学院第一附属医院药剂科，江西 赣州 341000；3.江西中医药大学研究生学院，南昌 330004）

腰椎手术失败综合征 （failed back surgery syndrome，FBSS）指在行椎板切除术或椎间盘摘除术后，患者仍有腰部、臀部或下肢的顽固性疼痛或其他不适症状，经过一段缓解期后复发［1］。 FBSS 发病率为5%～10%，硬膜粘连是FBSS 最常见的病因之一，再次手术效果成功率为30%～35%，并且15%～20% 的病例症状会加重［2］。因此，如何解决脊柱术后硬膜粘连的问题，对于改善患者的治疗效果具有极为重要的意义。 目前，比较一致的观点认为，单纯采用某一种方法很难达到理想效果。 将多种方法协同作用，或许能将瘢痕形成降低到比较少的程度［3］。为此，本实验采用聚-DL-乳酸（poly-DL-lactic acid，PDLLA）可吸收生物膜联合丹参注射液预防腰椎全椎板切除术后硬膜外粘连，取得了满意的效果，报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

PDLLA 可吸收生物膜（规格为50 mm×150 mm×0.2 mm，迪康中科生物医学材料有限公司，批号：M130101），丹参注射液（10 mL，安微天洋药业有限公司，批号：061242），HE 染色试剂盒（EYSIN 试剂盒，上海亿欣生物科技有限公司）。 BX51 光学显微镜（日本Olympus 公司）。

1.1.2 实验动物

选取清洁级新西兰大白兔60 只，雌雄兼有，年龄1～2（1.76±0.87）岁，体质量2.0～3.3（2.56±0.35）kg，由南方医科大学动物中心提供，动物合格证号：scxk粤2012-031。实验大鼠于南方医科大学动物中心普通兔饲料单笼饲养，饮水充足。 动物笼具内温度为（22±2）℃，湿度为（72±2）%，24 h 自动昼夜循环，光照10～12 h·d-1。

1.2 实验动物分组、动物模型的建立、给药方法及观察指标

1）将60 只新西兰大白兔按随机数字表法分为5 组：实验1 组（明胶海绵片组）、实验2组（明胶海绵片+丹参注射液组）、实验3 组（PDLLA 可吸收生物膜组）、实验4 组（明胶海绵片+丹参注射液+PDLLA 可吸收生物膜组）和空白对照组，每组12只。 2）5 组均于实验前1 d 禁食，采用3% 戊巴比妥钠30 mg·kg-1在兔耳缘行静脉注射麻醉。麻醉后，在无菌条件下，按背部后正中入路行腰椎（L5-7）全椎板切除术。 两椎体间肌肉不切断，咬除椎板面积，每个节段约为0.5 cm2×1.3 cm2。剔除硬膜外脂肪，充分暴露硬膜，动物模型均建立成功。 模型建立成功后，实验1 组、实验2组、实验3 组和实验4 组分别在椎板缺损处覆盖明胶海绵片、明胶海绵片+丹参注射液（将丹参注射液0.5 mL 倒入明胶海绵片中）、PDLLA 可吸收生物膜及明胶海绵片+丹参注射液+PDLLA 可吸收生物膜（将丹参注射液0.5 mL 倒入明胶海绵片中，上面再覆盖PDLLA 可吸收生物膜）。空白对照组不作任何处理。 5 组分别在术后2、4、8及12 周断颈处死大白兔各3 只，完整取下腰椎标本，观察大体标本的情况（L6 椎板缺损处瘢痕增生及明胶海绵片和防粘连膜的自身改变的情况），并于L6 椎板缺损处作横断面锯开，取椎板标本。 椎板标本脱钙后，置于4%多聚甲醛液中4 ℃冰箱固定24 h，乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片厚5 μm，进行常规HE 染色，具体操作步骤见试剂盒说明书。同时，采用Rydell 肉眼评判标准［4］和改良Nussbaum组织学评判标准［5］对5 组术后2、4、8 及12 周大体标本及光学显微镜下组织学变化的情况进行观察、评判（肉眼观察和病理学观察）。

1.3 大体标本粘连及瘢痕粘连程度评定标准

大体标本粘连、瘢痕粘连肉眼观察按文献［4］的标准进行评定。0 级：硬膜外瘢痕组织与硬脊膜无粘连；Ⅰ级：硬膜外瘢痕组织与硬脊膜有轻度粘连，但很容易钝性分离；Ⅱ级：硬膜外瘢痕组织与硬脊膜相粘连，不容易钝性分离，但强行分离不会造成硬脊膜的撕裂；Ⅲ级：硬膜外瘢痕组织与硬脊膜紧密相连，不能够钝性分离，强行钝性分离会造成硬脊膜的撕裂损伤。

瘢痕粘连组织学评定按文献［5］的标准进行评定。 0 级：硬膜外瘢痕粘连面积＜25%，胶原纤维稀疏，瘢痕无明显的侧方、后方延伸；0.5 级：硬膜外瘢痕粘连面积＜50%,胶原较致密,瘢痕侧方延伸到神经根和椎板间隙之间或部分嵌入椎板间隙；1 级：硬膜外瘢痕粘连面积＞50%,胶原致密,瘢痕包绕,延伸到一侧或双侧神经根,嵌入椎板间隙,硬膜囊或脊髓受压变形。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 术后及切口愈合情况

5 组术后2～4 h 进食、饮水恢复正常。 切口干燥，无渗液、红肿及感染。

实验1 组、实验2组、实验3 组、实验4 组和空白对照组的切口愈合时间分别为：（8.20±0.84）、（5.50±0.67）、（8.50±1.17）、（5.40±0.67）和（8.30±0.75）d，实验2、实验4 组的切口愈合时间与实验1 组、实验3 组和空白对照组比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

2.2 大体标本观察

实验1 组：术后2 周，有血肿形成和机化的肉芽组织，明胶海绵有吸收的迹象。 粘连程度为0 级。术后4 周，瘢痕形成,但粘连可分离。 明胶海绵降解成碎片，剩余近1/2。粘连程度为Ⅰ级。术后8 周，瘢痕明显，且质地变硬，但强行可分离。 明胶海绵降解成较小的碎片，几乎被完全吸收。 粘连程度为Ⅱ级。术后12 周，硬膜外瘢痕组织与硬脊膜紧密相连，已不能钝性分离。 明胶海绵被完全吸收。 粘连程度为Ⅲ级。

实验2组：术后2 周，无机化的肉芽组织，明胶海绵开始吸收。粘连程度为0 级。术后4 周，少量瘢痕形成，无粘连，可轻松分离。 硬脊膜与椎板间留有腔隙。 明胶海绵降解成碎片，剩余近1/3。 粘连程度为0 级。 术后8 周，少量瘢痕形成，无粘连，但很容易分离。 硬脊膜与椎板间留无明显腔隙，明胶海绵被完全吸收。 粘连程度为0 级。 术后12 周，轻度瘢痕形成，并轻度粘连，但很容易钝性分离。 明胶海绵较多的吸收。 粘连程度为Ⅰ级。

实验3 组：术后2 周，硬脊膜完好，硬脊膜与椎旁肌间可见少量的薄膜状肉芽组织及与椎板间松动、无粘连。 粘连程度为0 级。 术后4 周，硬脊膜分解为大碎片， 但与背侧椎旁肌间有一层假膜相隔，无粘连。硬膜外血管清晰。明胶海绵降解成碎片，剩余近1/3。 粘连程度为0 级。 术后8 周，硬脊膜吸收近1/3，无瘢痕、无粘连，且有潜在腔隙形成，粘连程度为0 级。 术后12 周，硬脊膜基本降解吸收。 硬膜外瘢痕有些增生，但不严重，尚能分离。 硬膜外无间隙，粘连程度为0 级。

实验4 组：术后2 周，硬脊膜完好，未见肉芽组织。 硬脊膜与椎板间松动、无粘连，硬脊膜与椎板间留有腔隙，硬膜外血管清晰。明胶海绵开始吸收。粘连程度为0 级。 术后4 周，硬脊膜分解为较大碎片，硬脊膜与椎板间松动、无粘连，硬脊膜与椎板间留有腔隙，硬膜外血管清晰。 明胶海绵降解成碎片，剩余近1/2。 粘连程度为0 级。 术后8 周，硬脊膜吸收近1/3，无瘢痕、无粘连，且有潜在腔隙形成。 明胶海绵剩余近1/4。粘连程度为0 级。术后12 周，硬脊膜剩余近1/3，无瘢痕、无粘连，但硬脊膜与椎板间隙不明显。明胶海绵基本降解吸收。粘连程度为0 级。

空白对照组：各不同时间点的大体标本观察的结果与实验1 组相同。

2.3 病理学观察

实验1 组：术后2 周，成纤维细胞增生活跃，并伴大量吞噬细胞。 粘连明显，但易分离。 术后4 周，粘连广泛，明胶海绵部分吸收。 术后8 周，胶原致密。瘢痕粘连，不易分离。术后12 周，大片成纤维细胞和大片的瘢痕粘连。

实验2组：术后2 周，无明显成纤维细胞，但伴有少量吞噬细胞，胶原稀疏。 无明显粘连。 术后4周，少量成纤维细胞增生和吞噬细胞，无明显粘连。术后8 周，成纤维细胞和吞噬细胞较前要多。 有轻度粘连，但易分离。 术后12 周，成纤维细胞增生明显，胶原轻度致密。 瘢痕有粘连，但易分离。

实验3 组：术后2 周，无明显肉芽组织形成，背侧肌肉间有少量薄膜状肉芽组织，但中性粒细胞反应明显，成纤维细胞增生不活跃，胶原稀疏。 术后4周，炎性细胞（中性粒细胞、嗜酸粒细胞、单核巨噬细胞、淋巴细胞和浆细胞）反应减轻。 椎旁肌与PDLLA 生物膜间有膜状纤维组织，与硬脊膜无粘连。 术后8 周，硬膜外未见瘢痕组织，但可见骨缺损边缘骨母细胞增生活跃。 术后12 周，有散在的、较小的碎片PDLLA 生物膜，硬膜与瘢痕无粘连。

实验4 组：术后2 周，无明显肉芽组织形成，薄膜与背侧肌肉间有少量薄膜状肉芽组织，但中性粒细胞反应较明显，成纤维细胞增生不活跃，胶原稀疏。术后4 周，炎性细胞反应明显减轻。背侧椎旁肌与膜间有膜状纤维组织，胶原密度低，与硬膜无粘连。术后8 周，炎性细胞反应较前减轻。硬膜外无明显瘢痕组织，骨缺损边缘骨母细胞增生活跃。 术后12 周，无炎性细胞，但有少量瘢痕。硬膜外有部分空腔隙，硬膜与瘢痕无粘连。

空白对照组：在不同时间点的病理表现与实验1 组相同。

2.4 瘢痕粘连的等级评判

实验2组、实验3 组和实验4 组术后Rydell评级为0、Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ级瘢痕粘连的例数均显著低于实验1 组和空白对照组（均P＜0.01）。 见表1。

表1 5 组术后Rydell 评级的瘢痕粘连结果 例

实验2组、实验3 组和实验4 组术后改良Nussbaum 组织学评级为0、0.5 及1 级瘢痕粘连的例数均显著低于实验1 组和空白对照组 （均P＜0.01）。 见表2。

表2 5 组术后改良Nussbaum 组织学评级的瘢痕粘连结果例

3 讨论

全椎板切除术及椎间盘摘除术是脊柱外科常见的手术，术后硬膜外瘢痕增生、粘连也是造成术后症状不能缓解和手术失败的主要原因之一，其机制主要是由于术中所造成的损伤需通过成纤维细胞的增生来修复。 在修复过程中，由早期肉芽组织和晚期瘢痕组织的形成所致，但成纤维细胞的来源目前存在争议。1948 年，Key 等［6］首先提出纤维化形成的“前源学说”，并认为，术中损伤纤维环是造成硬膜粘连的主要原因。 1974 年，LaRocca 等［7］又提出了“后源学说”，并认为，术后硬膜和神经根周的粘连主要来自直接覆盖在硬膜上未经处理的骶棘肌粗糙面和手术中剥离的骨膜纤维层。 在此基础上，1995 年，Songer 等［8］于是提出“三维立体学说”，并认为，硬膜周围瘢痕既有来自后方损伤的骶棘肌，又有来自前方损伤的纤维环和后纵韧带，而且形成的粘连又会向神经根周围发展，导致侧方受累。1992 年，Touliatos 等［9］亦认为,合并血肿的软组织创伤,无论在椎管的哪一个部位，均会引起硬膜周围的纤维化与粘连。 本研究中，光学显微镜下观察结果显示，术后2、4、8 及12 周椎板切除部位瘢痕内有新生的肌纤维细胞，且背侧多于腹侧,各周的瘢痕组织背侧较腹侧成熟早。 因此，笔者也认为,椎板切除后，粘连形成主要源自于椎管后方的创伤、血肿和成纤维细胞的增生。

目前，预防腰椎术后硬膜外粘连的材料非常丰富，大体可以分为下列几类［10］：1）硬体材料，如自体板层骨、聚甲基丙烯酸甲酯（polymethylmethacrylate，PMMA）、人工椎板、钛网及Kiel bone。 2）软体材料，如游离脂肪、膨体聚四氟乙烯（ePTFE）及聚乳酸材料。 3）半流体材料，如透明质酸（hyaluronic acid，HA）、几丁质及聚合纤维素（PCMC）。 还有作为化学屏障的药物，如甾体类消炎药及丝裂霉素C 等。

本研究中所用的PDLLA 可吸收生物膜是以聚-DL-乳酸为原料生产的软体材料，该产品为白色织物状，具有良好的柔软性和贴附性，在术中应用不需要进行缝合固定。PDLLA 可吸收生物膜具有微孔结构（孔径1～3 μm），可以透过水分子和空气。 必要时，可在PDLLA 可吸收生物膜中添加各种医用辅助材料，改善膜的柔软性、透气性和降解速度。PDLLA 可吸收生物膜在椎板切除术后应用时，主要是利用膜的屏障作用，将成纤维细胞和血肿有效地隔开。可维持屏障作用2 个月左右，3～6 个月可完全降解为乳酸，并通过三羧酸循环形成水和二氧化碳排出体外［11］。 另外，PDLLA 可吸收生物膜完全吸收后,其背侧形成的瘢痕组织，即成自然的屏障,在硬膜外形成潜在腔隙。 本研究结果显示，放置PDLLA可吸收生物膜后，硬膜外腔隙未见瘢痕粘连。 表明，PDLLA 医用膜确实起到了屏障隔离的作用。

丹参注射液是临床最常用的活血化瘀药物，具有活血化瘀、理气通络之功效。 有研究［12］认为，其预防硬膜外粘连的优点是：1）药物来源广泛，安全、可靠，不良反应小。 2）剂型稳定，容易调控剂量。 3）丹参水溶性成分具有活血化瘀，改善微循环的作用。可以促进局部血肿的吸收，避免局部血肿机化。 4）丹参有激活纤溶系统，具有促进纤维蛋白溶解，抑制纤维细胞增殖和分泌，降低纤维蛋白原，减少胶原纤维形成和纤维组织增生等抗纤维化的药理作用。本研究结果显示，实验2组、实验3 组和实验4 组术后Rydell 评级为0、Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ级瘢痕粘连的例数均显著低于实验1 组和空白对照组（均P＜0.01），实验3 组、实验4 组术后Rydell 评级为0、Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ级瘢痕粘连的例数与实验2组比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。同样，实验2组、实验3 组和实验4 组术后改良Nussbaum 组织学评级为0、0.5 及1 级瘢痕粘连的例数均显著低于实验1 组和空白对照组（均P＜0.01），实验3 组、实验4 组术后改良Nussbaum 组织学评级为0、0.5 及1 级瘢痕粘连的例数与实验2组比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。 这些结果表明，丹参有明显地抗纤维化及抗粘连的作用，并且减轻了机体的炎性反应。 本研究结果还显示，实验2组、实验4 组的切口愈合时间与实验1 组、实验3 组和空白对照组比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）。 进一步证实了丹参的活血化瘀、理气通络之功效。

总之，明胶海绵+丹参注射液+PDLLA 可吸收生物膜的防粘连效果更为突出，而且还能减轻机体的炎性反应，是一种临床上预防术后硬膜外粘连较为理想的材料。

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