补肝益肾法对更年期模型大鼠行为变化的调节作用*

刘 莹，赵宏艳，于 峥，时彦菊，刘 红，潘静华，于志静，鞠大宏，喻长远△

(1.上海市松江区方塔中医医院妇科，上海 201600;2.中国中医科学院中医基础理论研究所，北京 100700;3.北京化工大学，北京 100700)

“肝肾同源”是中医脏腑相关理论的重要内容之一，在临床上有着广泛的应用，对该理论的阐明将有助于更好地指导临床实践。本文从方药角度对“肝肾同源”理论开展研究，欲对“肝肾同源”理论有进一步的认识。

1 材料

1.1 实验动物

选用健康雌性 SPF级 SD大鼠96只，体质量200～220 g，由中国药品生物制品检定所提供(许可证编号SCXK(京)2009-0017)，在中日友好医院临床研究所动物室屏障系统(实验动物室许可证号SYXK(京)2005-0019)。

1.2 药物

实验所用中药材(山茱萸、丹皮、熟地、泽泻)购自北京同仁堂药店。补肝药物水煎液(山茱萸30 g，丹皮10 g)、益肾药物水煎液(熟地30 g，泽泻10 g)、补肝益肾药物水煎液(山茱萸15 g，丹皮5 g，熟地15 g，泽泻5 g)，常规水煎制浓缩，生药含量均为0.3688g/ml。此药物浓度是按人日用临床剂量，经人-大鼠体表面积比值折算成相当于人临床剂量而成。

2 方法

2.1 模型制作及分组

大鼠适应喂养1周后，随机选取16只作为正常对照组和假手术组，其余大鼠麻醉后，行双侧卵巢切除手术制作更年期模型大鼠[1]。手术组大鼠的手术过程同造模组，但不切除卵巢，只切除卵巢周围的脂肪组织。术后7 d作阴道涂片，观察造模后动物动情周期，每天1次，连续5 d，挑选不显周期性改变的大鼠为更年期动物模型。将造模成功的75只大鼠随机分为模型组、己烯雌酚组、补肝药物组、益肾药物组、补肝益肾药物组5组，每组15只。

2.2 给药

造模型成功后，对各给药组大鼠灌胃给药:补肝药物组大鼠灌服补肝药物水煎液3.688 g生药/kg体质量;益肾药物组大鼠灌服益肾药物水煎液3.688 g生药/kg体质量;肝肾同补药物组大鼠灌服肝肾同补药物水煎液3.688 g生药/kg体质量;己烯雌酚组大鼠灌服己烯雌酚水溶液0.046 mg/kg体质量。以上给药每天1次，连续4周。空白对照组、假手术组、模型组大鼠按上法灌服等体积纯净水。

2.3 取材

给药4周后将大鼠断头处死，立即取出子宫和阴道并称重，每只大鼠的子宫和阴道重量(g)分别与对应大鼠体质量(g)的比值为子宫和阴道系数。

2.4 指标的测定

2.4.1 大鼠一般状态观察 每天仔细观察大鼠的精神状态、皮毛色泽、活动度及粪便等全身情况。实验开始后每7d用电子秤称量大鼠体质量，并根据体质量调整给药量。

2.4.2 大鼠行为方法的测定 采用旷场实验法测定，具体方法如下:实验用黑色有机玻璃自制旷场箱，该箱为立方形，长 ×宽 ×高为105 cm×105 cm×50 cm，内侧壁及底面为黑色。旷场箱正上方安置摄像头，在安静无干扰并杜绝参照物的环境条件下进行。操作者握住大鼠尾根部1/3处，轻轻将大鼠放入旷场箱的正中，开始同步录像、计时。观察5 min内大鼠活动情况。取出大鼠后，用毛巾蘸清水及低浓度酒精彻底擦拭箱底，并等待其挥发扩散，避免留有气味而干扰下只大鼠的观察结果。观察如下指标来量化大鼠的情绪状态:大鼠总路程、平均速度、静止时间、进入中心区次数。旷场实验的分析方法:运用动物行为活动标记分析系统Xeye Aba V3.1软件，对各组大鼠的行为进行分析评价。

2.5 统计学处理

3 结果

3.1 补肝益肾药对各组大鼠体质量的影响

给药前，去势大鼠体质量与假手术组比较有上升趋势，但差异无统计学意义。

给药7d后，与假手术组比较，模型组、补肝药物组、益肾药物组和补肝益肾药物组大鼠体质量明显上升(P＜0.05，P＜0.01)，而己烯雌酚组大鼠体质量明显下降(P＜0.05);与模型组比较，己烯雌酚组大鼠体质量明显下降(P＜0.01)。

从给药后14d起至给药结束，与假手术组比较，模型组、补肝药物组、益肾药物组和补肝益肾药物组大鼠体质量明显上升(P＜0.01)，己烯雌酚组大鼠体质量明显下降(P＜0.01);与模型组比较，己烯雌酚组大鼠体质量明显下降(P＜0.01)，补肝药物组、益肾药物组和补肝益肾药物组与模型组比较差异无统计学意义;补肝药物组、益肾药物组和补肝益肾药物组大鼠体质量明显高于己烯雌酚组(P＜0.01)。补肝药物组、益肾药物组和补肝益肾药物组之间大鼠体质量差异无统计学意义。

表1 各组大鼠体质量变化(g)

3.2 补肝益肾药对各组大鼠子宫和阴道重量/系数的影响

与假手术组比较，模型组、己烯雌酚组、补肝药物组、益肾药物组和补肝益肾药物组大鼠子宫和阴道重量明显下降(P＜0.01)，其系数亦明显下降(P＜0.01，P ＜0.05)。

与模型组比较，己烯雌酚组大鼠子宫和阴道重量差异无统计学意义，但其系数显著升高(P＜0.01);补肝益肾药物组大鼠子宫和阴道重量与其系数明显升高(P＜0.01，P＜0.05)，补肝药物组、益肾药物组和与模型组比较，子宫和阴道重量与其系数有上升趋势，但差异无统计学意义。

补肝药物组、益肾药物组、补肝益肾药物组与己烯雌酚组比较，子宫和阴道重量明显升高(P＜0.01)，但系数却较低(P＜0.01)。

3.3 补肝益肾药对各组大鼠焦虑行为(旷场实验)的影响

与假手术组比较，模型组和己烯雌酚组大鼠总路程、平均速度明显升高(P＜0.01，P＜0.05)，静止时间明显下降(P＜0.01);补肝药物组、益肾药物组及补肝益肾药物组大鼠与假手术组比较差异无统计学意义。

与模型组比较，己烯雌酚组大鼠总路程、平均速度及静止时间差异无统计学意义;补肝药物组大鼠平均速度明显下降(P＜0.05)，静止时间明显上升(P＜0.01);益肾药物组大鼠平均速度明显下降(P＜0.01)，静止时间明显上升(P＜0.01);补肝益肾药物组大鼠总路程、平均速度明显下降(P＜0.01，P＜0.05)，静止时间明显上升(P＜0.01)。

与己烯雌酚组大鼠相比，补肝药物组大鼠静止时间明显上升(P＜0.01);益肾药物组大鼠平均速度明显下降(P＜0.05)，静止时间明显上升(P＜0.01);补肝益肾药物组大鼠总路程、平均速度明显下降(P＜0.05)，静止时间明显上升(P＜0.01)。各组大鼠进入中心区次数差异均无统计学意义。

表2 各组大鼠子宫和阴道重量及其系数的变化

表3 各组大鼠总路程、平均速度、静止时间及进入中心区次数的变化

4 讨论

更年期综合征是指更年期妇女因卵巢功能衰退，引起机体内分泌失调、免疫力低下和植物神经功能紊乱为主要特征的一组证候群。中医理论认为，更年期综合征虽与五脏功能失常、阴阳气血失衡有关，但因妇女年届绝经前后，大多已经历了经、孕、产、乳几个阶段，且妇女绝经前后肾气渐衰，天癸将竭，极易耗血伤精，损伤肝肾，所以本病当主要源于肝肾二脏的精血虚少，而出现功能衰退和失调。因此，在治疗上临床常采用补肝益肾法治疗更年期综合征。补肝益肾法实为中医“肝肾同源”的体现，“肝肾同源”主要是阐述肝与肾二脏关系之密切。本文以六味地黄丸为基础方，观察方中补肝药物、益肾药物及补肝、益肾药物联用对更年期模型大鼠的治疗作用，以期从方药角度为阐明“肝肾同源”内涵提供进一步的实验依据。

目前其国内外更年期综合征主要有自然衰老、卵巢摘除、X光照射破坏卵巢3种动物模型。因去势动物模型造模时间短，模型成功率高，所以本实验选用去势法制作更年期综合征动物模型。本实验结果显示，去卵巢法制作的更年期模型大鼠，体质量明显增加，子宫及阴道重量与系数明显下降，补肝益肾药物治疗后可明显增加子宫及阴道重量与系数，补肝药物、益肾药物虽有增加趋势，但无统计学意义。

旷场实验是目前最常用的一种动物心理实验方法。通过记录大鼠进入一个新异环境后，在一定时间内的探究行为和自发活动的情况，以反映大鼠在新环境中的探究行为和适应能力[4]。本实验利用摄像监控手段，对大鼠的活动进行监测，因而能对大鼠的焦虑、抑郁程度进行客观分析。本课题选用旷场实验中有代表性的观察指标，主要有大鼠总路程、平均速度、静止时间、进入中心区次数，并对其情绪状态进行分析。实验结果显示，模型组大鼠与假手术组比较，总路程、平均速度明显升高，静止时间明显下降，说明模型组大鼠焦虑、抑郁程度高，这与临床更年期的症状有相似之处。与模型组比较，补肝药物组大鼠平均速度明显下降，静止时间明显上升，表明补肝药物对大鼠的焦虑情绪有较好的调节作用;益肾药物组大鼠静止时间明显上升，总路程、平均速度有下降趋势，但与模型组比较差异无统计学意义，说明益肾药物对更年期大鼠有部分调节作用;补肝益肾药物组大鼠总路程、平均速度明显下降，静止时间明显上升，反映补肝益肾药物对大鼠的焦虑情绪有很好的调节作用;而己烯雌酚组大鼠总路程、平均速度及静止时间与模型组比较差异无统计学意义，这一结果部分反映益肾药物、补肝药物和补肝益肾药物对更年期大鼠精神方面的调节作用要优于己烯雌酚。补肝药物与益肾药物联合使用对更年期模型大鼠的子宫及阴道重量与系数、行为学变化改善作用要好于单独使用补肝药与益肾药物，从方药的角度部分诠释了“肝肾同源”的内涵。

[1]鞠大宏，于福禄，张丽坤，等.滋阴补肾法对卵巢切除所致骨质疏松大鼠成骨细胞COX-2蛋白和mRNA表达的影响[J].中国中医基础医学杂志，2006，14:44-46.

[2]Eilam D.Open-field behavior withstands drastic changes in arena size[J].Behav Brain Res，2003，14(2):53-62.