宁神温胆汤对大鼠海马凋亡蛋白bax、bcl-2表达的影响*

胡久略，谢 辉，龙志江，孟 琼，张彦辉，贺又舜

(湖南中医药大学，长沙 410007)

神经病理学提示精神分裂症存在着神经元凋亡，这可能是其发病的重要机理之一[1]。“痰”作为一种病邪，内可影响到脏腑，外可影响到筋骨，上逆则精神错乱[2]。温胆汤临床用治无形之痰所致的精神疾患，课题组前期研究发现对多巴胺神经递质有效[3]。本实验在温胆汤原方基础上增加了酸枣仁、石菖蒲，以增强安神作用，并主要探讨了宁神温胆汤对精神分裂症模型鼠海马神经细胞促凋亡蛋白bax、抑凋亡蛋白bcl-2表达的影响，以揭示该药抗精神分裂症的部分作用机理，为临床推广提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物 SD雌性大鼠 40只，SPF级[5]，体质量200±20g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供(实验动物许可证 SCXK(湘)2009-0001)。饲养条件:每笼5只，室温25±2℃，相对湿度65±5%，标准饲料，全营养喂养，自由饮水，笼具每周清洗消毒1次，紫灯灭菌10 min。实验动物在实验室饲养房内观察5d，无异常者用于本试验。鼠用全价颗粒饲料由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供(实验动物专用饲料生产许可证SCXK(湘)2009-0009)。

1.1.2 药物 酸枣仁、石菖蒲、半夏、竹茹、枳实、陈皮、茯苓、甘草购自湖南中医药大学附一院药剂科，由湖南中医药大学中药鉴定教研室鉴定。酸枣仁为小乔木植物酸枣 Ziziphus jiujiuba Miill.var.spinosa(Bunge)Hu ex H.F.Chou.的成熟种子，石菖蒲为南星科植物石菖蒲 Acorus tatarinowii Schott.的干燥根茎，半夏为南星科草本植物半夏 Pinellia ternata(Thunb.)Breit.的块茎，竹茹为禾本科植物淡竹 Phyllostachysmigra var.henonis.Stapf的茎的中间层，枳实为芸香科植物酸橙Citrus aurantium L的幼果，陈皮为芸香科植物橘 Citrus reticulata Blanco的成熟果皮，茯苓为多孔科真菌茯苓 Poria cocos(Schw.)Wolf的菌核，甘草为豆科草本植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch的根茎。

1.1.3 试剂 (R)-(-)阿朴吗啡盐酸半水(日本和光纯药工业株式会社，批号20110408)、盐酸氯丙嗪注射液(上海和丰制药有限公司，批号091201)、生理盐水(四川科伦药业股份有限公司，批号B11050207)、bax、bcl-2试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司，批号BA0315、BA0412)。

1.1.4 仪器 PG802-S型电子天平(梅特勒-托力公司，德国)，MAIS医学图像分析系统(北航公司，中国)，CM-1800恒温冰冻切片机(山顿公司，英国)，MoticB5双目生物显微镜(麦克奥迪实业集团有限公司，中国)。

1.2 实验方法

1.2.1 中药汤剂制备 宁神温胆汤组成:酸枣仁 10g，石菖蒲 10g，半夏 10g，竹茹 10g，枳实 10g，陈皮10g，茯苓30g，甘草6g。全方各药物先加水浸泡30min，煎时加药材量8倍的水，沸腾后煎40min过滤取汁;二煎加药材量6倍的水，沸腾后煎30min过滤，两煎所得滤液混合后浓缩成药物与水的比例为1∶1，4℃ 冰箱保存。

1.2.2 动物模型建立 动物适应饲养环境5d后进行试验，随机分为正常组、模型组、宁神温胆汤组、氯丙嗪组4组，每组10只。最后1d给药1h后，正常组左侧腹腔注射2mg·kg－1生理盐水，其他3组大鼠左侧腹腔按2mg·kg－1(注射量为0.1mL/20g)的标准注射阿朴吗啡盐酸半水，诱发SD大鼠精神分裂症模型，观察15min后断头处死。

1.2.3 给药方法 宁神温胆汤组于造模前连续灌胃给药，每次给药 20mL·kg－1(相当于灌胃20mg·kg－1);氯丙嗪组先连续灌胃等容量生理盐水14d，每天1次，最后7d腹腔注射盐酸氯丙嗪4.5mg·kg－1(按体表面积计算，相当于正常人用量);正常组和模型组用等容量生理盐水灌胃，每天灌胃1次，共21d。

1.2.4 大鼠海马神经细胞bax、bcl-2蛋白指标测定 诱发SD大鼠精神分裂症模型观察15min后，对大鼠麻醉下行左心室主动脉插管后，给予4%多聚甲醛(4℃)灌注固定，迅速断头取脑后固定。用恒冷冰冻切片机行冠状面连续切片，从视交叉处开始切片，片厚10～12μm，每个标本切片10到12张。0.3%H2O2室温下孵育10min;滴加5%BSA血清封闭液37℃20min:滴加一抗4℃ 过夜;加生物素化二抗37℃ 30min;加SABC37℃ 20min;DAB显色，剃度酒精脱水;二甲苯透明;中性树胶封片。每组次染色切片数均衡以避免DAB显色时间不等对组间造成的影响。一抗稀释浓度为1∶200。采用 MAIS医学图像分析系统进行图像分析。每张切片随机测定5个视野，在400倍视野下测光密度值，取其均值作为该鼠的平均光密度值。

1.2.5 数据统计分析 统计分析采用SPSS 16.0统计软件，所有数据用均数±标准差(s)表示。所有统计检验均采用双侧检验，符合正态性和方差齐性的资料采用LSD检验，不符合正态性和方差齐性的资料采用秩和检验，P＜0.05为差异有统计学意义，P＜0.01为差异有显著统计学意义。

2 结果

2.1 行为观察

分组喂养并观察各组大鼠体态、发育，每周称量体质量。氯丙嗪组在注射氯丙嗪后明显发现，本组大鼠精神萎靡、毛发稀疏、爬行缓慢、阴囊明显松弛，其他各组无此类表现。实验最后1d注射阿朴吗啡盐酸半水的3组大鼠同时出现不同程度的啃、咬、点头、乱爬等精神分裂症症状，以模型组最为明显。

2.2 病理检测结果

免疫组化法处理 bax、bcl-2后阳性细胞呈棕黄色。图2显示，正常组海马有3～4层锥体细胞，排列整齐紧密，神经细胞核大而圆，透明，胞质丰富，核仁清楚，胞浆无棕色颗粒表达;模型组大鼠海马区神经元bax阳性表达明显增多，bcl-2阳性表达明显减少;宁神温胆汤组、氯丙嗪组海马区bax阳性表达明显减少，bcl-2阳性表达均明显增多。

图1 各组小鼠海马区bax的表达(×400)

图2 各组小鼠海马区bcl-2的表达(×400)

2.3 宁神温胆汤对大鼠海马区bcl-2、bax蛋白表达的影响

采用免疫组织化学方法检测 bax、bcl-2蛋白表达，在400倍光镜下随机选取5个视野进行定量分析，测量棕黄色反应物的平均光密度，分析蛋白的表达情况。经统计学处理表明，与模型组比较，宁神温胆汤组、氯丙嗪组bax蛋白表达显著降低，bcl-2蛋白表达升高，bcl-2/bax比值升高，差异具有统计学意义(P＜0.01～0.05);宁神温胆汤组、氯丙嗪组组间比较，宁神温胆汤 bax高于氯丙嗪组，bcl-2及bcl-2/bax比值低于氯丙嗪组，差异具有统计学意义(P＜0.05)，说明宁神温胆汤能抑制海马区神经细胞的凋亡。

表1 宁神温胆汤对大鼠海马区bax、bcl-2蛋白表达的影响(n=10，s)

表1 宁神温胆汤对大鼠海马区bax、bcl-2蛋白表达的影响(n=10，s)

注:与模型组比较:▲ P＜0.01，★P≤0.05;氯丙嗪与温胆汤组间比较:■P＜0.05。

组bcl-2/bax正 常 组 0.2820±0.0426▲ 0.5480±0.0349▲ 1.9881±0.3503别 bax平均光密度 bcl-2平均光密度▲★■模 型 组 0.7750±0.0350 0.1550±0.0303 0.2006±0.0403宁神 温 胆 汤 组 0.4980±0.0391★ 0.2270±0.0464★ 0.4575±0.0955★盐酸 氯 丙 嗪 组 0.3980±0.4517★■ 0.4490±0.0340★■ 1.1372±0.1116

3 讨论

Bcl-2家族是膜的整合蛋白，根据功能和结构可分为两类，一类是抑制凋亡(anti-apoptotic)，如 Bcl-2、Bc1-xl、Bcl-w、Mcl-1; 一 类 是 促 进 凋 亡(proapoptotic)，如 Bax、Bak、Bad、Bid、Bim。Bcl-2 抗凋亡的机制目前认为主要有:(1)拮抗促凋亡蛋白bax;(2)抑制促凋亡蛋白细胞色素C自线粒体释放到胞质;(3)阻止胞质中的细胞色素C激活caspase。Bax是极重要的促细胞凋亡分子，表达十分广泛。主要定位于细胞质，受到凋亡因子诱导，向线粒体转位，并寡聚化在线粒体外膜形成跨膜通道，或者开启线粒体的PTP孔(线粒体通透性转换孔)，释放细胞色素C。大量研究发现，Bcl-2/Bax两蛋白之间的比例关系是决定对细胞凋亡抑制作用强弱的关键，因此Bcl-2/Bax构成一个凋亡过程变阻器。

本实验检测精神分裂症模型大鼠海马神经组织时发现，Bcl-2蛋白的表达明显下降，而 Bax蛋白的表达明显升高，导致Bcl-2/Bax的比例下降，说明精神分裂症可导致Bcl-2/Bax的比例下降，从而促进海马神经细胞凋亡，此结果与其他一些研究结果类似[6]。而宁神温胆汤干预治疗精神分裂症大鼠后出现Bcl-2蛋白的表达升高，Bax蛋白的表达下降，从而导致Bcl-2/Bax的比例升高，这说明宁神温胆汤抑制海马神经细胞凋亡信号通路作用机理是双向的，一方面可促进抗凋亡因子Bcl-2的分泌，另一方面可抑制促凋亡因子Bax的分泌，从而保证海马神经细胞发挥正常的生理功能，达到治疗精神分裂症的作用。

实验结果表明，宁神温胆汤对抑制精神分裂症大鼠海马区神经元有显著疗效。众所周知，临床治疗精神分裂症的西药分典型与非典型药物，包括氯丙嗪、氟哌啶醇、舒必利、氯氮平、奥氮平、利培酮等，它们在治疗过程中易出现锥体外系不良反应和镇静、体位性低血压与植物神经紊乱等不良反应，且对慢性迁延病程者疗效不佳，常发生体质量增加、高血糖、高血脂，以及持续的高催乳素血症导致的性功能异常和月经紊乱，少数发生肝功能、血象异常与心电图改变等副作用。我们在实验研究过程中，明显发现使用氯丙嗪后大鼠精神萎靡、毛发稀疏、发育减缓，因此探索温胆汤这类疗效好、副作用小的抗精神分裂症的中药复方甚为迫切。

[1]李国荣，朱娩儿.精神分裂症和神经元凋亡[J].中国神经疾病杂志，2007，33(10):634.

[2]邵建军.温胆汤加减在精神心理科应用132例[J].光明中医，2011，26(5):964.

[3]谢辉，贺又舜.温胆汤及其化学组份对大鼠纹状体DA合成作用影响的研究[J].中医杂志，2004，20(3):66

[4]贺又舜，傅俊英，袁振仪，等.温胆汤对小鼠中枢神经递质影响的实验研究[J].中国中医药杂志，1999，6(4):25

[5]徐淑云.药理实验方法学[M].北京:人民卫生出版社，2001:856.

[6]慕宝龙，田茸，舍雅莉，等.平痫颗粒对癫痫大鼠海马神经元细胞凋亡及基因表达的影响[J].中国中医药信息杂志，2012，19(6):35.