VEGF和MVD在大肠癌中的表达及预后意义＊

骆礼波，程家平，杨伟明，杨雪峰，石 磊，贺新媛，刘 勤，苏晓玥，任 宇

(1.遵义医学院附属医院甲状腺乳腺外科，贵州 遵义 563099;2.遵义医学院附属医院 胃肠外科，贵州 遵义563099)

大肠癌是常见消化道恶性肿瘤，影响患者预后是肿瘤的侵袭和转移能力。1971年，Folkman等就提出了“肿瘤血管生长因子理论”，认为:肿瘤的生长及转移依赖于新生血管生成［1］。多项研究表明，VEGF是目前研究较多，也较成熟的肿瘤新生血管诱发因子。Sharma等［2］指出MVD最有价值的是能预测实体肿瘤的侵袭和转移，并与实体肿瘤各种预后因素有关，是预测全身和局部复发及无病生存的重要指标。运用VEGF和MVD对大肠癌患者生存期进行评估，国内文献报道相对较少。本研究运用免疫组化方法(Envision法)来探讨VEGF和MVD在大肠癌组织中的表达与患者的病理特征与生存预后的关系。

1 材料与方法

1.1 一般资料 收集遵义医学院附属医院胃肠外科1997年3月至2007年2月生存期≥5年(甲组)及≤3年(乙组)大肠癌患者组织标本各30例。所有标本均经病理证实为大肠癌组织，全部患者均为第一次手术，术前均未接受任何放、化疗和其它治疗。甲组:男14例，女16例;年龄30～79(中位年龄50.1)岁。Dukes分期，A+B期16例，C+D期14例;有淋巴结转移11例，无淋巴结转移者19例。乙组:男18例，女12例;年龄27～73(中位年龄56.1)岁;Dukes分期，A+B期14例，C+D期16例;有淋巴结转移16例，无淋巴结转移者14例。60例中，29例未突破肌层，其余31例全部侵润至浆膜及浆膜层外。分化程度:高分化腺癌28例、中低分化腺癌及粘液腺癌32例。手术方式:Dixon术式32例;Hartmann术式14例;Mile，s术式24例。除3例因各种原因，未能进行放化疗，其余患者均采用folfox方案规范完成6个疗程化疗。

1.2 免疫组化试剂，仪器及其他耗材 特异性一抗是兔抗人VEGF单克隆抗体(编号M7273，工作液浓度1∶25)购于Dako公司;鼠抗人CD34单克隆抗体(工作液浓度1∶100)购于福州迈新公司。二抗试剂盒(编号GK500705，包括Envision二抗检测即用型，DAB显色试剂)购于美国基因公司。经多聚赖氨酸处理的防脱玻片，PBS缓冲液，EDTA抗原修复液及一抗稀释液均购于北京中杉金桥公司。另二甲苯，酒精，双氧水，苏木素，微波炉均为实验室自备。

1.3 实验方法

1.3.1 免疫组化染色 石蜡组织切割成4 μm厚切片，均经HE染色再次确认为所选组织学诊断后行免疫组化染色。二甲苯梯度脱蜡两次，每次10 min，乙醇梯度水化，3%双氧水浸泡10 min去除内源性过氧化物酶，EDTA微波修复抗原(CD34为10 min，VEGF为20 min)，自然冷却后 PBS液冲洗3次，每次5分钟，加一抗后4℃过夜。第二次PBS液冲洗3次，每次5分钟。滴加二抗，室温30℃后再次PBS液冲洗3次，每次5分钟。DAB显色，苏木素复染细胞核，乙醇梯度脱水，透明，中性树胶封片。以VEGF，CD34强阳性片为阳性对照，磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照。

1.3.2 结果判定

1.3.2.1 VEGF判断 以胞浆内出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性，每张切片选取10个不同部位，400倍视野下计数，采用Volm［3］标准，按阳性细胞数占总细胞数的比例和染色深度进行评分和分级。染色强度分级:无着色为0分，淡棕黄色为1分，棕黄色及更深颜色为2分;阳性细胞分级:阳性细胞数≤50%为0，＞50% ～75%为1分，＞75%为2分。两项得分相加，结果2分为阳性表达。

1.3.2.2 MVD判断 作为目前标记微血管最主要的CD34，其以血管内皮细胞胞膜染成棕黄色或棕褐色为阳性表达。MVD计数参照Maeda等［4］报道方法，计数5个高倍镜视野(×200)内微血管数，取平均数为该组织MVD值。以上免疫组化染色结果均由具备多年病理诊断经验的技术人员2人采用双盲法参与判定。

1.3.3 统计学处理 实验结果采用SPSS17.0统计学软件进行分析。计量资料采用t检验，计数资料采用检验，采用Spearman等级相关进行相关性分析。检验水准α=0.05，P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 VEGF，MVD 表达与性别，年龄，分化程度及病理分型关系 免疫组化显示:大肠癌组织中VEGF主要表达于肿瘤细胞的细胞浆或胞膜内，以胞浆内出现棕黄色或棕褐色颗粒阳性染色为主，以癌巢边缘着色最明显，表明VEGF表达最明显的部位位于肿瘤细胞浸润的前缘(见图1)。CD34是目前运用最多，也是较为成熟的标记微血管的蛋白，以血管内皮细胞胞膜染成棕黄色或棕褐色颗粒为阳性表达。主要表达于肿瘤间质区，微血管数量以肿瘤周边相对较多(见图2)。60例中，VEGF阳性表达率为53.3%(32/60)，MVD 值为32～72，平均为46.77。两者与性别，年龄，分化程度及病理分型无关(见表1)。

2.2 VEGF，MVD 表达与浸润深度，临床分期，淋巴结转移间关系 VEGF，MVD在癌细胞浸润的浆膜及浆膜外，C+D期，有淋巴结转移的表达分别为67.7%(21/31)，66.7%(20/30)，70.4%(19/27);50.45 ±11.34，51.47 ±10.60，51.74 ±10.02 。均显著高于肌层，A+B期，无淋巴结转移的37.9%(11/29)，40.0%(12/30)，39.4%(13/33)，42.83±7.15.42，07 ±7.36.42，70 ±8.54，差异有统计学意义(＜0.05)。

2.3 VEGF，MVD表达与生存期，患者的预后关系生存期≥5年的大肠癌患者与≤3年的大肠癌患者血管内皮生长因子表达分别为36.7%(11/30)，70.0%(21/30)，而生存期≥5年的大肠癌患者与≤3年的大肠癌患者微血管密度表达分别为41.53±6.08，52.00 ±10.89。差异较为显著，有统计学意义(＜0.001)。本实验发现，VEGF着色及阳性细胞数表达越多的切片，相对应的MVD值越高。两者呈正相关(r=0.974，P ＜0.05)。

表1 大肠癌组织中VEGF、MVD的表达与临床病理参数关系

3 讨论

Folkman指出:血管的形成根据肿瘤的发展分为血管前期和血管期。在血管前期，实体瘤缓慢生长或不生长，多数直径不超过1 mm，很少向周围浸润，几乎不发生转移［5］。一旦进入血管期，肿瘤必须要建立自身的血管系统以获得充足的氧和营养成分，生长速度加快，瘤体向周围侵袭。由于新生肿瘤血管内皮细胞不完整或基底膜中断，缺如、脱落肿瘤细胞容易进入血液循环，引起肿瘤的侵袭，转移。可以说，肿瘤血管的新生在肿瘤良恶性间，恶性肿瘤分期及淋巴结转移间扮演了极其重要角色。血管的新生需要多种诱发因子，如细胞因子，生长因子，细胞外基质复合物(ECM)等［6］。作为生长因子的VEGF家族是多种静脉及毛细血管的有丝分裂原，与肿瘤的侵袭，转移密切相关［7］，它由肿瘤细胞分泌且相对分子量为34～46KD，具有生物活性的糖蛋白单体以二硫键构成的二聚体。VEGF家族包刮 VEGF－A，VEGF－B，VEGF－C，VEGF－D等，通常说的VEGF是指VEGF－A。研究表明，VEGF被认为是最主要的血管形成因子［8］，主要表达于肿瘤细胞的细胞浆或胞膜内，肿瘤组织内间质和临近正常组织内也可见少量表达。它以下列两种方式引起肿瘤生长:①以旁分泌方式刺激血管内皮细胞增值，诱发肿瘤血管再生;②可以作为自分泌因子作用于肿瘤细胞自身的VEGF受体促进肿瘤生长。MVD是肿瘤微血管形成程度的标志和肿瘤的生物学特征，是目前评定肿瘤血管生成状态的最佳指标。已有多项研究表明，在卵巢癌，肝内胆管癌，乳腺癌等的MVD的高低与肿瘤的复发和转移密切相关［9－11］。

本实验表明，VEGF阳性表达越高的组织，其MVD测量值越大，说明VEGF确实在恶性肿瘤新生血管的形成中起重要作用。VEGF的高表达和大肠癌的Dukes分期，癌组织浸润，淋巴结转移和预后密切相关，VEGF对大肠癌的生长和转移有促进作用。Kang等［12］采用免疫组化法分析大肠癌VEGF表达阳性与肿瘤血管分布，肝转移的关系，发现有肝转移和静脉浸润的患者，其癌细胞VEGF表达阳性率高于无转移者，且阳性患者微血管含量较阴性高，与国内张涛、王瑞婷等［13－14］报道的相一致。检测VEGF及MVD的表达可以成为判断大肠癌的进展情况及为预后提供依据。

由于血管内皮细胞遗传学上稳定，突变率低，所以针对内皮细胞的药物较少出现耐药的问题［13］。因此阻断大肠癌细胞表达的VEGF信号传递可以防止肿瘤的生长。BREDOW等［15］用反义寡核苷酸治疗肾癌，在裸鼠肿瘤模型中，可以明显降低VEGF的表达和微血管密度以抑制肿瘤生长，抗VEGF的中和性单抗具有广谱的抗肿瘤作用，对移植于裸鼠的人体癌瘤有明显疗效。所以抑制VEGF的活性肯定能遏制大肠癌的发展，以VEGF为靶点的生物治疗大肠癌有很大的发展空间。

［1］Weidner N.Tumor angiogenesis:review of current applications in tumor prognostication［J］.Sem in Diag Pathol，1993，10(4):302 －313.

［2］Sharma S，Sharma M C，Sarkar C，et al.Morphology of angiogenesis in human cancer:a conceptual overview.histoprgnostic perspective and significance of neoangiogenesis［J］.Histopathology，2005，46(5):481 －489.

［3］Brekken R A，Thorpe P E.Vascular endothelial growth factor and vascular targeting of solid tumors［J］.Anticancer Res，2001，21(6B):4221.

［4］Maeda K，Chung Y S，Ogawa Y，et al.Prognostic value of vascular endothelial growth factor expression in gastric carcinoma［J］.Cancer，1996，77(5):858 －863 .

［5］Folkman J.W hat’s the evidence that tumors are angiogenesis denpendent［J］.J Natl Cancer Inst ，1990，82(1):4 －6.

［6］Cross M J，Claesson － welsh L.FGF and VEGF function in angiogenesis:signaling pathways.biological responses and therapeutic inhibition［J］.Trends Pharmacol Sci，2001，22:201 －204.

［7］冯树，宋今丹.大肠癌分化浸润和转移与细胞基质的关系［J］.中国肿瘤临床，1997，24(2):100.

［8］Liang J，Wang H，Xiao H .Relationship and Prognostic Significance of SPARC and VEGF Protein Expression in Colon Cancer［J］.J Exp Clin Cancer Res，2010，29(1):71.

［9］程艳，姚丽.卵巢癌中PGRmc1基因表达与微血管密度的关系［J］.中国肿瘤临床，2012，39(9):583 －586.

［10］傅翔，王济明，张雷，等.肝内胆管癌组织中PIGF的表达与 MVD 的关系［J］.重庆医学，2012，41(12):1152－1154.

［11］刘芳.乳腺癌恶性程度与HGF/c－met，端粒酶，微血管密度相关性研究［J］.中国妇幼保健，2012，36(4):6013－6015.

［12］Kang S M，Maeda K，Onoda N，et al.Combined analysis of p53 and vascular EndothelialGrowth Factor expression in colorectal carcinoma for determination of tumor vascularity and liver metastasis［J］.Int J Cancer，1997，74(5):502.

［13］张涛，郭建平.血管内皮生长因子在大肠癌组织中的表达及其临床意义［J］.中国医学工程，2007，15(7):570－573.

［14］王瑞婷，申兴斌，张泓波.VEGF在大肠癌中的表达及意义［J］.山东医药，2006，46(35):57－58 .

［15］Bredow，Lewin M，Hofmann B，et al.Imaging of tumour neovasculaturc by targeting the TGF－beta binding receptorendoglin［J］.Eur J Cancer，2000，36(5):675 －681.