SELDI蛋白质芯片技术在肝癌中的应用

农世泽，黄承乐，梁林慧，冯国钢，王献民（广西壮族自治区百色市人民医院检验科 533000）

血清甲胎蛋白（AFP）多年来一直作为诊断肝癌的重要参考依据，但是仍不够理想，大量临床数据也表明肝癌患者AFP阳性率波动在60%～70%，超过30%的肝癌患者即使到了中、晚期血清AFP也表现为阴性或低浓度阳性[1－5]。此外，慢性肝炎、肝硬化患者中AFP也有一定的阳性率[6]。因此单独应用AFP诊断肝癌可能导致AFP阴性的肝癌患者漏诊，或者AFP低浓度阳性的肝癌患者难以和一些肝脏良性疾病相鉴别。表面增强激光解吸电离飞行时间质谱（SELDI－TOF－MS）技术是近年发展起来的一种蛋白组学研究方法，以这一技术为基础开发的蛋白质芯片可以非特异性或特异性地结合被测样本中的各种蛋白质，进而筛选疾病不同阶段时期的特异性相关蛋白质，能提高疾病的临床诊断效率的疾病诊断。基于SELDITOF－MS技术的巨大优势和AFP低浓度阳性时鉴别肝癌的局限性，设计了以下实验。

1 资料与方法

1.1 一般资料 以13.2μg/L＜AFP≤400μg/L判为AFP低浓度阳性，肝癌组共28例，男20例，女8例，平均年龄为（53.1±7.3）岁；肝病组共34例，男25例，女9例，其中慢性肝炎患者22例，慢性肝炎后肝硬化患者12例，平均（47.1±9.7）岁。

1.2 研究方法

1.2.1 样品检测 取血清10μL，加入2倍体积U9缓冲液稀释。将30μL上述变性后样品加入360μL结合缓冲液（50 mM乙酸钠，pH4.0）。将CM10蛋白芯片装入生物芯片处理器，每孔加入100μL样品，振荡1h。每孔加入200μL结合缓冲液，振荡5min，甩去液体，加入缓冲液重复操作一次，每孔加入羟乙基哌嗪乙磺酸200μL，立刻甩出。取出芯片，待干后，每孔加三氟乙酸0.5μL，自然干燥，上机测定。

1.2.2 数据采集 采用蛋白芯片生物系统Ⅱ－c型蛋白芯片阅读仪读取芯片信息。芯片阅读仪参数设置如下：激光强度180，检测灵敏度8，优化范围为质荷比（m/z）2 000～10 000。采用Ciphergen ProteinChip Software 3.2版本的分析软件自动采集数据，信噪比（S/N）大于5为有效波峰。

1.3 统计学方法 图谱标准化后用Biomarker Wizard软件计算各蛋白峰在组间差异的P值，用Biomarker Patterns Software软件对差异蛋白峰值做线性分类分析，最后构建诊断模型。

2 结 果

2.1 差异蛋白峰的筛选 28例AFP低浓度阳性肝癌患者和34例AFP低浓度阳性肝病患者血清的原始蛋白指纹图谱经同样处理，在m/z 2 000～50 000范围内共检测到39个蛋白峰，其中29个蛋白峰两组差异有统计学意义（P＜0.05）。与AFP低浓度阳性肝病组相比，AFP低浓度阳性肝癌组血清中有5个蛋白峰上调，24个蛋白峰下调，见表1。

表1 29个蛋白峰在两组蛋白指纹图谱的Mean数据比较

2.2 诊断模型的建立与验证诊断模型 由BPS完成，通过对原始图谱的初步判断，从筛选出的29个差异蛋白峰中选择m/z为6 452的蛋白峰得到一个比较合理的决策树模型（诊断模型）。该模型区分AFP阳性肝癌患者与AFP阳性肝病患者的准确率为85.5%（53/62），灵敏度为82.1%（23/28），特异度为88.2%（30/34），阳性预测值为85.2%（23/27），阴性预测值为85.7%（30/35），阳性似然比为6.982，阴性似然比为0.202，见表2。

表2 两组患者诊断模型的评价（n）

3 讨 论

血清AFP一直被视为肝癌普查、早期诊断和疗效评估的重要指标之一，但是仍不够理想，有30%～40%的肝癌患者血清AFP呈阴性，其原因可能有：（1）肝癌细胞有不同细胞株，有的能合成AFP，另一些只能合成清蛋白；如后者在癌灶中比例大，血清AFP可不升高。（2）在瘤体直径小于3cm的小肝癌患者中，AFP可正常或轻度升高。（3）不是肝细胞癌，而是纤维板层癌或胆管细胞癌，AFP阳性极少见。因此目前迫切需要发展能用于临床血清AFP阴性或低浓度阳性肝癌的诊断标志物。

研究表明，血液中可能含有大量从未被发现的可作为疾病标志物的多肽[7]。这是因为疾病早期及不同的发展阶段在蛋白水平上就可表现出细微但重要的变化[8]。分析这些早期发生的蛋白质变化，有望获得临床早期诊断的生物学标志物。SELDI－TOF－MS技术是蛋白质学研究的一项全新技术，具有高通量、高灵敏度和重复性好等特点，克服了双向电泳、光谱及其他质谱等技术存在的缺点，目前已应用于多种肿瘤早期诊断的研究。本文期望建立能通过SELDI－TOF－MS技术与血清AFP低浓度阳性结果联合使用从而在整体上提高肝癌的临床诊断效率的疾病诊断模型。应用SELDI－TOF－MS技术，本文发现了29个具有统计学意义的差异蛋白峰，其中在AFP低浓度阳性肝癌组血清中有5个蛋白峰上调，24个下调，对这些差异蛋白峰的研究将有助于解决血清AFP低浓度阳性肝癌患者与血清AFP低浓度阳性肝病患者不容易鉴别的问题。在后续的验证实验中，以m/z为6 452的蛋白峰建立的诊断模型，对血清AFP阳性肝癌患者与AFP阳性肝病患者的准确率为85.5%，灵敏度为82.1%，特异度为88.2%，阳性预测值为85.2%，阴性预测值为85.7%，阳性似然比为6.982，阴性似然比为0.202。该模型能较好地区分血清AFP阳性肝癌患者与血清AFP阳性肝病患者，联合血清AFP检测可以有助于肝癌的诊断和鉴别诊断。

由于疾病本身的复杂性和个体差异的影响，以及实验研究过程中的种种影响因素，经研究得出的诊断模型，其实用价值的实现尚需要经过实验条件的进一步优化和规范化以及多中心大样本的验证研究才能得以完成。尽管目前SELDI－TOFMS蛋白质芯片系统存在许多不足，但至今为止仍是高通量系统检测蛋白质多样性的惟一技术平台，随着蛋白质芯片技术的不断完善与进步，它将使蛋白质在肝癌发生、发展中作用的研究取得一系列重大突破，为人类的健康事业作出巨大贡献。

[1] Spangenberg HC，Thimme R，Blum HE.Serum markers of hepatocellular carcinoma[J].Semin Liver Dis，2006，26（4）：385－390.

[2] Trevisani F，D′intino PE，Morselli－Labate AM，et al.Serum alpha－fetoprotein for diagnosis of hepatocellular carcinoma in patients with chronic liver disease：influence of HBsAg and anti－HCV status[J].J Hepatol，2001，34（4）：570－575.

[3] Giardina MG，Matarazzo M，Morante R，et al.Serum alpha－L－fucosidase activity and early detection of hepatocellular carcinoma：aprospective study of patients with cirrhosis[J].Cancer，1998，83（12）：2468－2474.

[4] Marrero JA，Su GL，Wei W，et al.Des－gamma carboxyprothrombin can differentiate hepatocellular carcinoma from nonmalignant chronic liver disease in American patients[J].Hepatology，2003，37（5）：1114－1121.

[5] Tsai JF，Jeng JE，Chuang LY，et al.Serum insulin－like growth factor－II as a serologic marker of small hepatocellular carcinoma[J].Scand J Gastroenterol，2005，40（1）：68－75.

[6] Daniele B，Bencivenga A，Megna AS，et al.Alpha－fetoprotein and ultrasono－graphy screening for hepatocellular carcinoma[J].Gastroenterology，2004，127（5Suppl l）：S108－S112.

[7] Liotta LA，Ferrari M，Petricoin E.Clinical proteomics：written in blood[J].Nature，2003，425（6961）：905.

[8] Liotta LA，Kohn EC.The microenvironment of the tumourhost interface[J].Nature，2001，411（6835）：375－379.