猪精子不同处理方式对其IVF的影响

刘潆蔚，田见晖，庞云渭，郭 敏，杨美玲，张 倩，王晓红，安 磊*，张林波

(1.吉林农业大学 生命科学学院生物制药创新实验室，吉林 长春 130118;2.中国农业大学 动物科学技术学院/农业部动物遗传育种与繁殖重点实验室，北京 100193)

猪精子不同处理方式对其IVF的影响

刘潆蔚1，2，田见晖2，庞云渭2，郭 敏2，杨美玲2，张 倩2，王晓红2，安 磊2*，张林波1*

(1.吉林农业大学 生命科学学院生物制药创新实验室，吉林 长春 130118;2.中国农业大学 动物科学技术学院/农业部动物遗传育种与繁殖重点实验室，北京 100193)

猪体外受精(in vitro fertilization，IVF)技术效率的不稳定性限制了该技术在畜牧生产中的应用。本研究比较了精子获能前后的状态和活精子数之间的关系;精子获能后的浓度和状态对IVF后胚胎卵裂率、囊胚率的影响;不同个体来源的精子混合后对IVF卵裂率、囊胚率的影响。结果表明:精子获能前后，活精子数无显著性差异(P＞0.05);检测精子的浓度与状态与卵裂率、囊胚率无直接关联;利用混合精子进行IVF，单一精子所得到的IVF囊胚率分别是A 17.00%、B 12.24%、C 33.00%、D 4.81%、E 10.00%、F 22.00%，混合精子的囊胚率分别是A+B 77.00%、C+D 67.01%、E+F 35.50%，混合精子和单一精子的囊胚率差异不显著。

猪;体外受精;精子;获能

安磊，男，讲师。E－mail:anleim@yahoo.com.cn

长期以来，猪的体外受精(IVF)一直存在技术效率低、稳定性差的问题，具体表现为多精入卵率高、雄原核形成率低、IVF后胚胎发育率低等［1］。相关研究报道表明，精子的质量和处理方式等因素对猪的IVF效率存在显著影响。Piotr Miciński的研究结果表明，精子形态和活力并不能有效地反映其受精能力［2］。而精子在获能前的浓度与状态能否反映精子获能后的相关指标，以及精子的受精能力还有待确定。

诸多研究表明，不同个体、不同批次的精子，各项指标及受精能力差异很大［3～8］，这也是导致IVF体系不稳定的重要因素之一。因此，通过对不同来源的精子进行混合，可能会减少或弥补个体及批次间差异对IVF效率造成的不利影响。同时，观察混合后精子活力、数目等指标能否得到改善，以及囊胚率是否有所提高。

本实验比较了精子在获能前后的状态和密度，研究了获能后精子的状态对IVF卵裂率和囊胚率的影响。同时，研究了不同个体来源的精子混合对IVF胚胎发育效率的影响，为猪IVF效率的改进提供技术参考。

1 材料和方法

1.1 卵巢和卵母细胞的采集

猪的卵巢取自北京周边屠宰场。将离体卵巢立即放入装有预热的加有双抗的38.5℃生理盐水的保温瓶中，2 h内运至实验室。

1.2 猪的精液

猪的精液来源于北京中顺景盛种猪改良有限公司。

1.3 实验用主要试剂

TCM－199购自美国Gibco公司;其余药品均购自美国Sigma－Aldrich公司。

基础成熟培养液为TCM－199。新购的M199(500 mL)需加青霉素G 0.0325 g，链霉素0.025 g，溶好后过滤。添加的10%卵泡液，添加终浓度为0.1 mg/mL的L－半胱氨酸和终浓度为10 ng/mL的表皮生长因子。

操作液TL:65.0 mol青霉素、50 mg/mL链霉素、114.00 mol NaCl、3.20 mol KCl、2.00 mol NaHCO3、2.00 mol CaCl2·2H2O、0.34 mol KH2PO4、0.50 mol MgCl2·6H2O、10.00 mol HEPES、10.00 mol乳酸钠、0.20 mol丙酮酸钠、12.00 mol D－山梨醇、0.3%BSA，pH=7.2。

受精液为改良Tris缓冲液(mTBM)，成分为:113.1 mol NaCl、3.0 mol KCl、7.5 mol CaCl2·2H2O、20.0 mol Tris、11.0 mol葡萄糖、5.0 mol丙酮酸钠、2 mol咖啡因、0.2%BSA，pH=7.6～7.8。

胚胎培养液PZM－3:108.00 mol NaCl、10.00 mol KCl、0.35 mol KH2PO4、0.40 mol MgSO4·7H2O、25.07 mol NaHCO3、0.20 mol丙酮酸钠、2.00 mol Ca－(lactate)2·5H2O、1.00 mol L－谷氨酰胺、5.00 mol牛磺酸、20.00 mol BME、10.00 mol MEM、0.065 mol青霉素G、0.050 mol链霉素、4.00 mol BSA，pH=7.2～7.4。以上所有试剂都用0.22μm滤器过滤。

1.4 猪卵母细胞体外成熟

猪卵巢用含有双抗的生理盐水清洗两次后转入38.5℃的水浴锅中。用20 mL注射器选择2～6 mm的卵泡抽取卵丘卵母细胞复合体(COCs)，用TL清洗两次，在镜下挑取包裹有3层以上的COCs。

将挑选的COCs在覆盖有石蜡油预先平衡好的TCM－199微滴中洗3次，转入覆盖有石蜡油预先平衡好的TCM－199培养微滴中(100μL)，每滴100个卵母细胞，培养48 h。培养条件是5%CO2的空气，38.5℃及100%相对饱和湿度。

1.5 猪精液的处理

取出3 mL精液，在处理前先取出100μL，用细胞计数板进行计数，并在显微镜下观察精子的活力 (活率)，游动状态，是否断尾及死精的多少，并记录统计。吸取2 mL精液先用TL清洗并离心两次，再用mTBM清洗离心一次，然后在5%CO2的空气，38.5℃及100%相对饱和湿度的培养箱中获能40 min。取上浮的精子300μL在显微镜下计数，观察状态并进行实验。

1.6 卵母细胞的体外受精

将成熟好的COCs脱除颗粒细胞，挑取排出第1极体的卵母细胞。用mTBM做受精液，每滴50μL，每滴放入15～20个，然后向每个受精滴放入50μL受精获能后的精液，单一精液组共分为6组，分别命名为A、B、C、D、E、F，混合组分别分为A+B、C+D、E+F。放入5%CO2，38.5℃及100%相对饱和湿度的培养箱中受精6 h，受精结束后转入覆盖有石蜡油预先平衡好的PZM－3微滴(70μL)中洗掉精子，再换入覆盖有石蜡油的预先平衡好的PZM－3培养微滴中进行培养，每滴70μL，30个卵母细胞。培养2 d后观察卵裂率，7 d观察囊胚率。

1.7 统计分析

数据结果用平均数±标准差表示(Mean±SD)，利用SPSS中One Way－ANOVA过程对数据进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 获能前后精子数目、状态的比较

精子在获能前后均用细胞计数板进行计数，并在显微镜下观察精子的活力 (活率)、游动状态的情况，以及是否断尾及死精的比例(图1)。

图1 不同种公猪获能前后精子数的比较

结果表明，精子在获能前后其活精子数、死精子数无必然联系，数据差异不显著(P＞0.05)。同时，观察发现精子的状态在获能前后也不存在关联性。同一精子在获能前畸形多，精子存在凝集现象，但是获能后直线运动的精子所占比例很高，且畸形精子率很低;反之，获能前精子活力很好，直线运动精子数很多，但在获能后却有相当一部分“转圈运动”，甚至出现畸形精子。

2.2 精子的数目、状态对卵裂率和囊胚率影响

用不同个体的精子进行体外受精，记录卵裂率与囊胚率。与相对应的精子状态、数目进行比较分析(图2)。

图2 获能后上浮精子数和IVF所得卵裂率、囊胚率比较

结果表明，不同批号，不同批次精子的数目相差很大，而相对应精子所做IVF所得到的卵裂率和囊胚率与精子的数目无关(P＞0.05)。结果显示，受精前包括活率、密度等指标在内的精子状态与受精后胚胎发育效率之间并不存在明显趋势性关联。因此，精子的状态并不是理想的预测其受精能力的指标。例如，并不是直线运动多的、畸形率低的精子，囊胚率与卵裂率就一定高。

2.3 精子混合与单一个体精子进行IVF，卵裂率和囊胚率的对比

不同个体的精子进行混合，与混合前的精子，分别进行IVF，观察卵裂率及囊胚率(图3)。

图3 单独精液和混合精液IVF结果比较

结果表明，混合精子的IVF的卵裂率分别是A+B:77.00%、C+D:67.01%、E+F:35.50%，囊胚率分别是 A+B:28.50%、C+D:22.84%、E+F:3.00%，单一个体精子所得到的IVF卵裂率分别是A:76.00%、B:61.22%、C:82.00%、D:22.12%、E:34.00%、F:53.00%囊胚率分别是 A:17.00%、B:12.24%、C:33.00%、D:4.81%、E:10.00%、F:22.00%。由此可见，利用单一个体的精子，与不同个体来源精子混合后的IVF卵裂率及囊胚率没有显著关联。

3 讨论

本实验中，获能前的精子数量和状态对获能后的精子数量和状态没有显著影响，获能后的精子数量和状态也不能决定IVF的囊胚率和卵裂率的高低。通过混合不同个体来源的精子并不能达到稳定IVF胚胎发育效率的目的。有研究表明，最佳受精的精子终浓度为10×106［8］。从以上结果可以发现，精子数量在这个范围内才能进行IVF是不完全可信的。本实验的精子数量有个别没有达到要求，但是所得囊胚率却也并不低于其他组。精子数量过高，会导致IVF过程中粘附在卵母细胞表面的死精过多而影响配子的发育，有可能会导致囊胚率降低。当然，过多的精子也会导致多精入卵。但是多精入卵也不完全是由获能后精子的数量的多少决定，精子穿透透明带的能力也是一个重要的原因。

虽然在本实验中获能后精子状态与IVF胚胎发育效率并无显著的相关，但较好的精子状态仍然是保证猪IVF效率的重要指标，这种精子必须能够进行顶体反应，顶体反应是精子受精能力的重要先决条件［8，9］。本研究中所用获能后精子状态有一些运动方式为转圈运动，并且观察的视野范围内有很多畸形精子。但我们统计囊胚率发现没有必然影响。分析原因，很有可能是因为这些精子中部分精子仍具有较强的受精能力，并且能够进行高效的顶体反应。这也说明精子浓度不一定需要达到10×106才能够完成受精，具体的原因和内在机理需要进一步的研究。

混合精子后，我们预期的想法是活力强的精子带动活力较差的精子加强上浮能力，更有利于筛选质量高的精子，完成顶体反应达到受精的同时，稳定囊胚率。但是，不同个体来源精子混合后所得的囊胚率与单一个体精子的囊胚率相比没有显著性差异。下一步的研究，需要对其囊胚的质量、细胞总数以及凋亡细胞数进行观察与分析。

猪的IVF技术不仅是家畜体外胚胎技术体系中极其重要的环节，同时为受精机理和干细胞研究等提供了重要的研究材料。对于猪的干细胞而言，被认为在人类疾病及药物筛选模型、组织修复与替换中都具有极强的应用潜力。但是目前真正的猪胚胎干细胞仍未建成［10～12］，而猪 IVF效率低下被认为是主要制约因素之一［13］。所以，提高和稳定猪IVF对未来猪的胚胎干细胞等实验的开展有着至关重要的作用。

［1］Takashi Nagai，Hiroaki Funahashi，Koji Yoshioka，et al.Update of in vitro production of porcine embryos［J］．Frontiers in Bioscience，2006，11，2565 －2573．

［2］Piotr Miciński，Krzysztof Pawlicki，Ewa Wielgus，et al．Total reactive antioxidant potential and DNA fragmentation index as fertility sperm Parameters［J］．O-riginal research，2011，2，135－144．

［3］Alminana C，Gil M A，Cuello C，et al．Adjustments in IVF system for individual boars:Value of additives and time of sperm －oocyte co－incubation［J］．Theriogenology，2005，64，1783 –1796．

［4］Long C R，Dobrinsky J R，Johnson L A．In vitro production of pig embryos:Comparisons of culture media and boars ［J］．Theriogenology，1999，51，1375 –1390．

［5］Selles E，Gadea J，Romar R，et al．Analysis of in vitro fertilizing capacity to evaluate the freezing procedures of boar semen and to predict the subsequent fertility ［J］．Reproduction in Domestic Animals，2003，38，66–72．

［6］Sirard M A，Dubuc A，Bolamba D，et al．Follicle－oocyte－sperm interactions in vivo and in vitro in pigs［J］．Journal of Reproduction and Fertility，1993，48(Suppl．)，3 –16．

［7］Wang WH，Abeydeera LR，Fraser LR，et al．Functional analysis using chlortetracycline fluorescence and in vitro fertilization of frozen－thawed ejaculated boar spermatozoa incubated in a proteinfree chemically defined medium ［J］．Journal of Reproduction and Fertility，1995，104，305–313．

［8］S Martecikova，P Hulinska，Z Reckova，et al．Effect of acrosome reaction progress in frozen－thawed boar spermatozoa on the efficiency of in vitro oocyte fertilization ［J］．Journal of Veterinarni Medicina，2010，55，429–437．

［9］Birck A，Labouriau R，Christensen P．Dynamics of the induced acrosome reaction in boar sperm evaluated by flow cytometry［J］．Animal Reproduction Sci– ence，2009，115，124–136．

［10］Evans MJ，Notarianni E，Laurie S，et al．Derivation and preliminary characterization of pluripotent cell lines from porcine and bovine blastocysts［J］．Theriogenology，1990，33，125 –128．

［11］Hall V．Porcine embryonic stem cells:a possible source for cell replacement therapy［J］．Stem Cell Reviews，2008，4，275 –282．

［12］Telugu BP，Ezashi T，Roberts RM．The promise of stem cell research in pig and other ungulate species［J］．Stem Cell Reviews and Reports，2010，6，31–41．

［13］Thanh Q D，Tamas S，Seiki H，et al．In vitro production of porcine embryos:current status，future perspectives and alternative applications［J］．Animal Science Journal，2011，82，374 –382．

S828.3

A

1005－2739(2013)03－0016－04

2013－03－01

刘潆蔚(1987－)，女，吉林省人，在读硕士。E－mail:tongtong722@yahoo．cn

张林波，男，教授，硕士生导师，研究方向为免疫生物工程。E－mail:cczlb@126.com