乌头碱对胎鼠中脑多巴胺能神经元细胞的神经毒性作用

严妍，杨茂，Wolf-dieter Rausch，王喜军

(1.黑龙江中医药大学药学院，黑龙江 哈尔滨 150040;2.哈尔滨医科大学附属第四医院心内科，黑龙江 哈尔滨 150001;3.Department of Biomedical Sciences，Veterinary Medical University，Vienna，Austria，A-1210)

乌头碱(aconitine)来自于乌头属植物中所含的二萜类生物碱成分，几个世纪以来，乌头属植物作为祛风除湿止痛功效的药物，始终被中国和日本等国家的不同人群使用。乌头碱的治疗作用和毒性作用，发作时均反应迅速，可在几分钟内发生，且发生时与刺激电位的钠离子通道有关，这同样也是乌头碱产生神经毒素和心脏毒素的致毒机理所在［1－3］。乌头碱作为心脏毒素目前已被广泛和全面地研究，但对其神经毒性方面的研究甚少，仅仅集中在临床病例报道和症状描述方面。本实验从胎鼠原代中脑神经元细胞培养的层面研究乌头碱的神经毒性作用，通过神经元标志物信息的检测和提取来评价乌头碱对中脑神经元细胞的药理毒理作用，以更好地了解和预防乌头碱及其衍生物产生的神经毒性作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物、仪器和试刘

怀孕14 d的OF1/SPF小鼠，由奥地利Himburg医科大学动物中心提供。

层流式工作台(Holten Laminair，丹麦);NAPCO5410孵育箱(德国);倒置显微镜(Nikon);SMZ-1B解剖显微镜(Nikon)。

乌头碱(Sigma公司);ABC免疫组化试剂盒(Vector laboratories，USA);DMEM培养基、胎牛血清和二氨基联苯胺(DAB)试剂盒(德国 Sigma-Aldrich公司);二甲基亚砜(DMSO)(德国Merck公司);杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水(DPBS)、胰蛋白酶及胰蛋白酶抑制剂(Invitrogen公司)。

1.2 方法

1.2.1 中脑原代细胞培养 对OF1/SPF孕鼠的饲养及实验，均在欧洲联盟理事会(86/609/EU)的指导方针下进行。处死怀孕14 d的小鼠，乙醇消毒后打开腹腔，游离出子宫于新鲜DPBS溶液的平皿中，在层流式工作台上的解剖显微镜下取出胎鼠中脑，用纤维解剖刀将其切碎后转移至无菌试管内，加入2 mL 0.1%胰酶和2 mL 0.02%DNA消化酶，于37℃水浴箱内消化7 min。取出后加入2 mL胰酶抑制剂终止消化，于750 r/min条件下离心4 min，移除上清液后试管内加入3 mL基础培养基和6 μL DNA消化酶，用火焰抛光后的吸管吹打使细胞分散，静置10 min后取上清液，重复3次。取3 μL细胞溶液经台盼蓝染色，显微镜下计数后，调整细胞密度至750 000/mL。将细胞溶液加至4孔培养皿中，放置于5%CO2、37℃及100%湿度的孵育箱内培养。

1.2.2 乌头碱溶液的配制 以DMSO溶解配制浓度为 0.1，0.5，1，5，10，50 和 100 μmol/L 的乌头碱溶液，未加药物的为对照组。药物溶液用N-4培养液稀释。DMSO在培养液中的浓度为0.01%。

1.2.3 乌头碱作用于原代多巴胺能神经元细胞在多巴胺能神经元体外培养的第10天，将不同浓度的乌头碱溶液加入到培养皿中，并继续放置在5%CO2，37℃及100%湿度的孵育箱内作用48 h。

1.2.4 免疫组化鉴定酪氨酸羟化酶阳性(TH+)细胞 在体外培养的第12天移除培养液，以PBS洗涤后每孔加入可溶性聚四氟乙烯(PFA)0.4 mL，4℃条件下保存20 min，PBS溶液洗涤1次，2 min后每孔加入X-100溶液室温下保存30 min，PBS洗涤3次，每次2 min。加入马血清孵育90 min后加一抗(兔抗鼠多克隆抗体)4℃下过夜。第2天以PBS洗涤3次，每次2 min，加二抗(生物标记的山羊抗兔抗体)室温下保存1.5 h，PBS洗涤3次，每次5 min。加ABC免疫组化试剂盒，室温下保存1.5 h，以浓度为1.4 mmol/L的DAB室温避光下孵育10～15 min，移除DAB并以PBS洗涤后，加Kaiser's甘油明胶固定。细胞膜或胞质内出现棕色产物的细胞为TH阳性(TH+)细胞，即为多巴胺能神经元。

1.2.5 多巴胺能神经元细胞的形态学观察 使用Nikon倒置显微镜200×放大倍率下观察不同浓度的乌头碱作用下的TH+细胞的形态变化，与对照组的正常细胞生长趋势做比较。

1.2.6 多巴胺能神经元细胞的计数 在Nikon倒置显微镜100×放大倍率下每孔随机选取密度均匀的14个视野，记录TH+细胞个数，每个视野为1 cm2。

1.2.7 多巴胺能神经元树突的长度测量 使用倒置显微镜及Moticam 1 000相机200×放大倍率下，每孔随机选择10个细胞，应用软件Motic Images Plus 2.0测量照片中神经元细胞的树突长度。

1.2.8 多巴胺能神经元树突的计数 使用倒置显微镜及Moticam 1000相机200×放大倍率下，记录多巴胺能神经元细胞树突的数量，每孔随机选择10个细胞。

1.3 统计学处理

应用SPSS 17.0统计软件，数据以均值±标准差表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用Dunnett-t，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乌头碱对中脑多巴胺能神经元细胞形态的影响

不同浓度的乌头碱作用于培养10 d的中脑多巴胺能神经元细胞48 h后，于培养第12天进行免疫组化染色，在倒置显微镜200×放大倍率下可见，对照组神经细胞的胞体饱满，突触分支较多，神经纤维较长;而50 μmol/L和100 μmol/L乌头碱作用后的神经元细胞胞体出现明显皱缩，突触呈断裂状态，神经纤维萎缩变短，甚至缺失(图1)。

图1 乌头碱作用下的多巴胺能神经元酪氨酸羟化酶阳性细胞的形态学观察(免疫组化染色×200)Fig 1 Morphological observation of TH+cells in dopaminergic neurons with treatments of aconitine

2.2 乌头碱对中脑多巴胺能神经元细胞数的影响

乌头碱加入培养细胞中作用48 h后，与对照组相比，100，50和10 μmol/L乌头碱作用下的多巴胺能神经元细胞计数分别降低45%，31%和17%，差异有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)，见表 1，图2。

2.3 乌头碱对中脑多巴胺能神经元树突长度的影响

测量多巴胺能神经元树突长度发现，乌头碱溶液加入到细胞中作用48 h后，各浓度组的细胞树突长度均有不同程度的缩短，与对照组相比具有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)。其中，高浓度的乌头碱对多巴胺能神经元树突长度的影响比低浓度的乌头碱的作用更为显著，见表1，图2。

2.4 乌头碱对中脑多巴胺能神经元树突数量的影响

乌头碱作用于细胞48 h后，其对神经元树突数量的影响呈现浓度依赖关系。与对照组相比，100，50和10 μmol/L乌头碱作用下的多巴胺能神经元树突计数分别降低54%，53%和39%，低浓度乌头碱(5，1 和 0.5 μmol/L)作用后，多巴胺能神经元树突数量分别降低28%，16%和12%，差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。见表1，图2。

表1 乌头碱对多巴胺能神经元细胞数、树突长度和树突数量的影响Tab 1 Influences of aconitine on the cell numbers，the lengths and numbers of dendritic of dopaminergic neurons

图2 不同浓度乌头碱作用下的多巴胺能神经元TH+细胞数、树突长度及数量的变化(×100)Fig 2 Microscopic changes of the cell numbers，the lengths and numbers of dendritic of TH+neurons with different concentrations of aconitine.

3 讨论

无法控制的颤抖和运动障碍是乌头属植物引起神经毒性的典型症状，这种症状与多巴胺能神经通路的变性有关，亦有报道称乌头碱能引起多巴胺能神经毒性［4－6］。多巴胺能神经元为神经毒性药物的研究提供了良好的体外模型，而关于乌头碱对多巴胺能神经元的影响方面的研究，至今尚未见报道，因此，本实验选用中脑多巴胺能神经元进行细胞培养。胎鼠中脑原代多巴胺能神经元培养可以帮助了解神经退行性疾病的发病过程和机制，作为常用的体外模型目前已经广泛应用于各种毒理药理实验。

本实验结果表明不同浓度的乌头碱(0.5～100 μmol/L)，对神经细胞生长均有显著的抑制作用，并表现出浓度依赖性神经细胞毒作用;高浓度乌头碱(10～100 μmol/L)的抑制强度高于低浓度组(0.5～5 μmol/L)。此外，从TH阳性细胞的显微图像可以看出，乌头碱浓度的增加使中脑多巴胺神经细胞树突的长度和数量呈减少的趋势，并使细胞的形态发生改变，胞体出现收缩、变形、纤维缩短、数量减少等。

乌头碱对人的半数致死量(LD50)为2～4 mg(3～6 μmol/L)，但仅仅取决于临床的医疗规定。根据乌头碱的分子质量645.74 g/mol，我们可以从本实验结果中的乌头碱在细胞培养中的毒性浓度计算出成年人给予相同浓度的乌头碱的剂量，结果这个剂量将是非常高的致死剂量，并不能用于临床使用。因此，针对乌头碱的神经毒性来说，只有在相对高的浓度下，乌头碱才会表现出神经毒性和引起细胞死亡。在本实验中，低浓度的乌头碱对神经元的结构也造成了一定程度的破坏，这一结果等同于在体内功能受到干扰，从而引起渐进的神经退行性疾病。所以，体外实验不能模拟药物在体内的累积效应，同样在体外细胞模型上进行的药物实验剂量不能直接延伸到临床的治疗剂量。本次体外细胞培养实验研究中所得的结果，即乌头碱的神经毒性作用，今后有待在动物体内实验模型中实现验证。

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