大鼠肝癌发生过程中α-SMA及AFP动态变化

杨 智 符碧薇 江朝娜 蓝永洪

(海南医学院形态学实验室，海南 海口 571101)

甲胎蛋白(AFP)常常作为临床诊断原发性肝癌的一个临床指标〔1〕。肝纤维化与肝癌的发生有着密切的关系，α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的增加与肝纤维化有着密切关系〔2〕，因此α-SMA也用来辅助诊断原发性肝癌。本研究通过建立大鼠肝癌模型，研究大鼠肝癌进展过程中α-SMA和AFP的变化。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 雄性SD大鼠，体重160～200 g，约10周龄，购自于河北医科大学实验动物中心实验中心，寄养于洁净动物房内，给予自由饮水和标准饮食。

1.1.2 实验试剂 二乙基亚硝胺(美国Sigma公司)，鼠抗人平滑肌肌动蛋白单克隆抗体(上海亿欣生物试剂公司)，DAB试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)，山羊血清(上海恒远生物科技有限公司)，染色液(湖北泰康医疗设备有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠肝癌模型的建立 选取SD大鼠65只，随机分为对照组21只，整个实验过程中均饮用灭菌食用水。实验组35只，前4 w饮用灭菌食用水配置的二乙基亚硝胺，浓度100μg/ml，连续饮用4 w后，改饮普通灭菌食用水。与此同时另取9只SD大鼠，处理方法同实验组，作为实验备用组，用于作为实验组动物中途死亡的补充。

1.2.2 大鼠肝癌模型的病变过程 实验过程中，观察实验组和对照组大鼠的生存状况，并分别在第6，8，10，12，14，16，18 周处死5只实验组和3只对照组大鼠，取肝组织进行病理学检查，观测大鼠肝癌模型的进展状况。对所取组织常规行10%甲醛固定、石蜡包埋、切片，苏木精-伊红(HE)染色后进行病理组织学检查。

1.2.3 大鼠肝脏组织中α-SMA的表达 将上述取得的各组大鼠的组织立即固定，石蜡包埋制成切片，采用免疫组化技术测定大鼠肝脏组织中α-SMA的表达。结果分为:(－)阴性;(+)弱阳性;(⧺)阳性和(⧻)强阳性。

1.2.4 血清中AFP的检测 实验过程中在第6，8，10，12，14，16，18周处死大鼠时，分别取大鼠的血，离心取血清，按照试剂盒的操作规范，使用ELISA法分别检测AFP的水平。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0软件，所有数据均以表示，采用t检验，制图采用Graphpad Prism 5.0软件。

2 结果

2.1 各组大鼠的生存状况 对照组大鼠无异常现象，食欲良好，活动自如，无自然死亡。实验组大鼠在实验前期(前6 w)，与对照组无明显变化，随着实验时间的增加(8～18 w)，实验组部分大鼠出现食欲不振，活动减少状况，并在实验过程中出现实验大鼠死亡2例，死亡率5.71%，死亡大鼠又实验备用组大鼠补充继续试验。

2.2 大鼠肝癌模型的病变过程 在第 6，8，10，12，14，16，18周处死5只实验组和2只对照组大鼠，分别取出大鼠的肝脏，称取大鼠肝脏的重量。对照组大鼠从第6～18周，肝脏的重量只有少量增加;而实验组从第6～18周增加明显。并且从第10周开始，实验组大鼠肝脏的重量与对照组大鼠肝脏的重量相比，差异均具有统计学意义(P＜0.05)，实验组大鼠肝脏的重量明显重于对照组大鼠。见表1。

肝组织的电镜图显示，对照组大鼠肝组织结构正常，细胞排列规则。实验组大鼠6、8 w大鼠肝组织出现纤维化;第10周开始出现肝硬化，有假小叶产生，为肝癌初发期;第12、14周出现肝细胞异性，产生肝癌结节为早期肝癌现象;第16、18周出现肝癌细胞向正常组织浸润生长，为肝癌晚期症状。见图1。

2.3 大鼠肝脏组织中α-SMA的变化 对照组大鼠α-SMA在第6～18周在肝脏组织中基本不表达，或表达极弱。而实验组大鼠第6周表达极弱呈阴性(－);第8～10周肝癌初发时期，表达量有所增加，呈弱阳性(+);第12～14周早期肝癌，α-SMA表达呈阳性(⧺);第16～18周晚期肝癌期，α-SMA表达呈强阳性(⧻)。

2.4 血清AFP的变化 对照组大鼠在第6～18周，血清AFP浓度基本上无变化;实验组大鼠在第6～18周内，血清AFP浓度逐渐增大，且实验组大鼠在第 10、12、14、16、18周与相应时间的对照组相比差异显著(P＜0.05)。见图2。

表1 各组大鼠在肝癌进展过程中的肝脏重量，g)

表1 各组大鼠在肝癌进展过程中的肝脏重量，g)

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3 讨论

由于原发性肝癌是我国致死率较高的恶性肿瘤之一，因此建立完善的诊断标准十分紧迫。我国目前使用的是由中国抗癌协会制定的诊断标准，血清AFP含量以及结合影像学资料作为重要的指标〔4〕，但随着科技进步以及经验的积累发现现有的诊断标准尚有不足之处。但血清AFP含量作为原发性肝癌的诊断标准目前已发现有假阳性和假阴性〔5〕，因此尚需结合各种新的肝癌标记物综合诊断。因此为了临床更准确的诊断原发性肝癌，我们进行研究以期发现新的原发性肝癌标记物。

本研究采用的建立大鼠肝癌模型的方法，成功率高，为临床研究原发性肝癌提供新的思路。综上所述，根据本研究发现α-SMA及AFP含量的随着肝癌的进展逐渐增加，因此α-SMA结合AFP作为诊断指标更能准确地诊断原发性肝癌。

1 王丽娜，鞠吉雨，郑 洁，等.AFP-L3、HSP70及AFP水平在大鼠肝癌发展中的动态变化〔J〕.中国医药导报，2010;7(22):13-5.

2 季巍巍，宋育林，路 燕.非酒精性肝纤维化 a-SMA、E-钙黏素和Twist1的变化及意义〔J〕.安徽医药，2012;16(5):588-91.

3 刘 扬，吴孟超，钱光相，等.血液AFP mRNA在复发性肝癌及伴有肝外远处器官转移的原发性肝癌中的诊断意义〔J〕.第二军医大学学报，1999;20(3):192-3.

4 孟宪镛.肝癌标记物研究进展〔J〕.国外医学·内科学分册，1999;17(2):54-8.