哺乳动物促性腺激素抑制激素的生殖内分泌调节与行为作用

孟凡森，陈学群，杜继曾 综述

(浙江大学医学院基础医学系，浙江 杭州 310058)

哺乳动物脑内促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)于上世纪70年代初被分离、证实［1-2］。经过近30年的研究，认为GnRH是唯一参与调节垂体促性腺激素释放的神经肽。直到2000年，日本科学家Kazuyoshi Tsutsui首次从鹌鹑脑中分离并提纯了一种含有12个氨基酸的神经肽，由于它呈剂量依赖性地抑制前垂体细胞释放GnRH，被命名为促性腺激素抑制激素(Gonadotropininhibitory hormone，GnIH)［3］。近年研究发现，在哺乳动物中促性腺激素抑制激素RFRP不但调控生殖功能，还参与了季节性繁殖、应激反应、摄食以及焦虑行为等。

1 RFRP及其受体在脑内的分布(表1)

哺乳动物RFRP基因只编码2种成熟肽RFRP-1和RFRP-3。研究报道在大鼠中脑室注射RFRP-1，可以呈剂量依赖性地促进催乳素的释放［10］，而 RFRP-3与鸟类 GnIH功能相似。目前 RFRP-3 已经在大鼠［11］、牛［12］、猕猴［13］和人［14］中被分离纯化。经免疫组化研究发现，RFRPs(主要是RFRP-1)在小鼠中主要分布于间脑、脑桥和髓质以及下丘脑背内侧核(DMH)等区域［15］，而大鼠的RFRP-3神经元细胞体主要集中在DMH、结节乳头区和腹内侧核周围区域［16］。另一抗体的免疫组化和原位杂交研究发现，RFRP神经元细胞体仅存在于仓鼠、大鼠以及小鼠的DMH［17］。一种多克隆抗体(用第119-132位RFRP前体肽氨基酸残基的序列作为免疫原)的免疫组化研究进一步证实，RFRP神经元胞体主要集中在大鼠DMH［18］。

原位杂交实验结果显示，RFRP-3神经元存在于羊的下丘脑室旁核(PVN)和背内侧核腹侧［19］。利用不同抗体的免疫组化方法进一步证明了这一研究结果，原位杂交方法也获得类似结果，但唯一不同的是经历长周期光照(16∶8)的母羊室管膜RFRP免疫信号呈阳性［20］。

最近发现，灵长类动物雄性猕猴大脑PVN区中存在RFRP mRNA和免疫阳性细胞，并有大量的神经纤维投射到正中隆起［13］。但雌性猕猴中很少有神经纤维投射到正中隆起［21］。2009年 Ubuka实验室鉴定了人类大脑中的RFRP肽和其受体，发现RFRP神经元胞体主要分布在DMH，其轴突投射到视前区的GnRH神经元和正中隆起［14］。值得注意的是，在仓鼠［17］、羊［19-20］和灵长类［14］的正中隆起处均观察到 RFRP 神经元末梢，但大鼠中没有［16，19］。

表1 RFRP受体及其纤维投射分布Table 1 Distribution of RFRP fibers and RFRP receptor

RFRP神经元纤维广泛地投射到哺乳动物大脑的各个区域。在大鼠脑内，RFRP-3投射到下丘脑各个核团，发现神经末梢在杏仁核、终纹床核和丘脑室旁核等处。在GnRH神经元密集存在的区域视前区、隔核、布罗卡斜带中也有RFRP-3分布［16］。免疫组化双标研究显示，40%～80%的GnRH神经元胞体和RFRP神经元纤维在DMH区紧密连接。这些结果在灵长类［13］、大鼠［16-17］、羊［22］、仓鼠［17］和小鼠［23］的脑内也被发现，与鸟类中的研究结果相似。

研究报道，RFRP受体在大鼠下丘脑高度表达，在丘脑、中脑、髓质、眼和睾丸中度表达［10］;在羊的视交叉、视束上核、室旁核和结节部有分布［20］;在人类脊髓、杏仁核、尾状壳核、海马、黑质和丘脑表达［24］。此外，RFRP受体mRNA在大鼠垂体中有表达，而在人类垂体中没有发现［25］。

2 RFRP与生殖行为

2.1 对GnRH的调节 生殖轴整合大量直接或间接神经化学物质的信息输入并调节动物的生殖过程。对鸟类的研究已经证明，GnIH可以通过GnRH神经元上的受体抑制GnRH的释放［26］。大量的哺乳动物研究显示，GnRH神经元与RFRP神经纤维有紧密地连接［7］。在切除卵巢的仓鼠(未给予雌激素处理)［17］和性腺完好的大鼠(雌雄)中［16，27］，脑室注射 RFRP-3 降低了血浆促黄体生成素(LH)的水平，推测这是RFRP-3作用于 GnRH神经元的结果。Anderson等通过检测早期基因(c-fos)的方法发现，在切除卵巢的大鼠(给予雌激素或孕酮)中，RFRP-3减弱了GnRH的活动，同时也减弱了前腹侧室旁核(提供GnRH神经元刺激信号输入的区域)神经元的活动［27］。但是，在此实验中LH的释放并没有发生显著的变化。电生理学研究显示，在雄性和雌性小鼠的脑片上，RFRP-3可以抑制GnRH神经元的发放频率，其中约43%的GnRH神经元神经冲动释放频率减少，9%的GnRH神经元冲动的释放频率反而增加［28］。最新研究发现，西伯利亚仓鼠的下丘脑视前区(GnRH神经元细胞体聚集区域)存在RFRP受体，免疫荧光结果显示，GnRH神经元上存在 RFRP受体［29］。这是第一次在 GnRH神经元上发现RFRP受体，提示RFRP通过其受体在中枢调节GnRH，最终调节生殖功能，这对于全面阐述RFRP在调节生殖方面的重要作用有着非常重大的意义。

2.2 对垂体生殖激素的调节 RFRP在外周作用于垂体。给予切除卵巢的大鼠静脉注射RFRP-3对LH的基础浓度没有影响，但显著降低了 GnRH刺激引起的 LH释放［18］。然而，Murakami等却报道了一个相反的结果:给切除卵巢大鼠静脉注射RFRP-3降低了血浆LH，而脑室注射RFRP-3、LH的浓度和LH释放频率都没有明显变化［30］。为了进一步解释说明在大鼠中存在的差异性，最近Pineda等在大鼠中做了一个比较系统的研究［31］，研究者人工合成了不同的 RFRP类似物，包括2种 RFRP-1(RFRP1-12、RFRP1-20)和 2 种 RFRP-3(RFRP3-8、RFRP3-17)，利用脑室或静脉注射的方法，研究它们对LH和FSH的影响以及对体外培养的垂体细胞的影响。实验结果发现，①在切除卵巢的雌鼠中，脑室注射RFRP类似物后，只有RFRP3-8(含有8个氨基酸残基的RFRP类似物)可以抑制LH的释放，而RFRP3-17只有在高浓度时才有明显抑制LH释放的作用。2种浓度的类似物对FSH的释放无影响。②在成年雄性大鼠(性腺未切除)中，脑室注射RFRP3-8明显抑制LH，而FSH无变化;而在性腺切除的成年雄性大鼠中，实验结果相反。③静脉注射RFRP3-8后，在30～60 min可观察到LH的水平显著下降。在60～90 min内FSH水平下降。④在体外培养的切除性腺的雄性大鼠垂体细胞中，LH释放RFRP3-8呈剂量依赖性降低，而FSH没有显著的变化。

给予去卵巢母羊静脉注射RFRP-3后，发现LH的水平显著性降低，但是对垂体分泌的其他激素(生长激素和催乳素)没有任何影响［19］，在牛的研究中也得到了同样的结果［32］。在大鼠［30］、羊［19］和牛［32］的原代垂体细胞实验中，RFRP-3没有减少LH基础水平的释放，而是呈剂量依赖性地减少了GnRH刺激引起的LH释放。还有2个证据证明了RFRP-3对垂体的直接作用。第一，RFRP-3消除了GnRH刺激引起的促性腺细胞内钙的动员［19］;第二，GnRH刺激引起的羊垂体细胞LH β mRNA的升高可以被 RFRP-3 抵消［33］;此外，GnRH 刺激引起的细胞外信号调节激酶的磷酸化(ERK)也可以被RFRP-3消除［33］。这表明RFRP-3也可以通过第二信使信号通路抑制促性腺激素的合成。研究发现，RFRP-3可以减少GnRH刺激引起的体外羊垂体细胞FSH的释放［19］和FSH β mRNA 基因的表达［33］。

2.3 对性腺激素的调节 2000年第一次发现哺乳动物RFRP及其受体时，就确定其在大鼠睾丸内中度表达［10］。最近运用RT-PCR、原位杂交以及免疫荧光标记等方法，发现RFRP及其受体在叙利亚仓鼠的睾丸中的表达与生精周期有关，RFRP-3前体表达主要集中在曲精管［34］。在RFRP低水平表达的曲精管中，存在大量增殖的生殖细胞，提示RFRP可能对精子产生有抑制作用［35］。总之，哺乳动物睾丸中RFRP可能通过旁分泌或自分泌抑制生殖细胞增殖和分化。

排卵前期是LH释放的高峰，而在动情周期的其他时期，雌激素通过负反馈抑制LH释放。Gibson等研究了RFRP与LH释放的关系［36］。目前形态学已经证明视交叉上核对RFRP的节律控制。如注射生物素葡聚糖胺(BDA)示踪剂的研究发现，雌性叙利亚仓鼠中视交叉上核存在大量神经元投射到RFRP神经元集中的区域:DMH及其周围区域。在LH峰期间，DMH的RFRP免疫阳性细胞减少，处于激活状态的RFRP细胞减少;LH峰过后，阳性细胞数量恢复到基础水平。结果说明RFRP的节律性调节，而且提示可能参与排卵过程。另有研究雌激素对RFRP的作用，免疫荧光双标实验发现DMH大约有39%的RFRP神经元细胞与雌二醇受体共存。给卵巢切除的叙利亚仓鼠皮下注射雌激素，结果显示，注射雌激素组RFRP神经元的激活数目在3h和6h后都有显著性升高［17］。在动情周期的小鼠卵巢中发现GnRH和受体，结果提示GnRH和RFRP-3的相互作用共同参与了小鼠卵泡的发育和调控［37］。

3 RFRP与繁殖行为

Johnson等在雄性大鼠中证明了 RFRP-3对生殖行为的调节。分别在白昼给雄性大鼠脑室注射RFRP-3观察其对生殖行为的影响［16］。实验结果表明白天注射RFRP-3减少了生殖行为，而夜晚注射RFRP-3对生殖行为没有影响。

研究季节性繁殖的动物模型的动物通常是羊和仓鼠。羊是短日照繁殖的哺乳动物，DMH的RFRP蛋白的表达在非繁殖期高于繁殖期［22］，同时发现投射到GnRH神经元的RFRP神经元数目在非繁殖期也高于繁殖期。同样处于人工模拟长日照的羊，下丘脑RFRP基因的表达比繁殖期高［20］。所以推测RFRP可能是羊在非繁殖期抑制生殖功能的主要调节激素。然而羊在超长日照条件下(20 h或22 h)，RFRP基因的表达没有显著性变化。这些结果表明抑制效应不仅是通过长日照使RFRP基因表达增加，也与非繁殖期RFRP投射到GnRH细胞上的数目增加有关［22］。

在长日照繁殖的雄性叙利亚仓鼠和西伯利亚仓鼠中，免疫组织化学方法和原位杂交技术结果显示RFRP的表达在非繁殖期降低［38］，而且西伯利亚仓鼠在长日照的条件下RFRP前体的mRNA表达升高［29］。最近研究报道，在短日照条件下(非生殖期)的雄性叙利亚仓鼠中，发现RFRP免疫阳性神经元数目及其mRNA的表达比长日照条件下显著减少［39］。另一组研究报道，在模拟繁殖季节的长日照条件下西伯利亚仓鼠RFRP基因表达减少，当将其转入短日照时，RFRP 基因的表达增加［40］。

RFRP受褪黑激素的调节。在长日照繁殖的鸟类中，短日照模拟非繁殖期，褪黑激素分泌增加使鸟类GnIH的表达升高，抑制鸟类的生殖［41］。然而，在同样是长日照繁殖的叙利亚仓鼠中，给予短日照条件RFRP表达降低，松果体切除的方法可以恢复RFRP的表达，提示褪黑素在叙利亚仓鼠中抑制RFRP的表达;如果给予长日照条件，同时褪黑激素注射处理60 d，可以降低RFRP表达［38］。最近的研究显示短日照条件下，切除松果体的西伯利亚仓鼠，给予不同浓度的褪黑激素都可以使RFRP前体的mRNA的表达降低［29］。仓鼠和鸟类都是长日照繁殖动物，但它们之间有很多的差异。

4 RFRP与摄食行为

动物通过增加摄食储存能量为生殖和繁殖行为做准备。大鼠下丘脑背内侧核(DMH)是调节食欲和能量平衡的中心，同时又是RFRP神经元胞体集中的地方，所以推测RFRP与摄食行为直接相关。最初在鸟类中发现GnIH可以促进鸟类摄食［42］，RFRP-3在雄性大鼠中也有同样的作用［16］，随后在雌性大鼠中也证实了这个结果［30］。这是第一次确定了下丘脑背内侧核区域参与能量调节的神经元细胞类型。研究表明羊的RFRP神经元投射到神经肽Y和黑皮质素两种肽聚集的大脑区域［43］，而这两种神经肽都具有调节摄食和生殖的功能(神经肽Y促进摄食和负性调节生殖;黑皮质素负性调控摄食和激活生殖轴)。但限制雄性西伯利亚仓鼠进食(模拟仓鼠在夏季末生活的自然条件)，并没有发现RFRP表达的改变［40］。RFRP对能量和氧消耗的作用还需要进一步的深入研究。

5 RFRP与焦虑行为

脑室注射RFRP-1和RFRP-3后，大鼠旷场行为实验检测发现其在旷场中间活动的时间减少，在旷场中总活动减少，提示 RFRP-1和RFRP-3引起了大鼠的焦虑样行为［44］。在大鼠酒精撤退模型中，RFRP非选择性受体拮抗剂可以减弱动物焦虑行为［45］。这些数据提示，RFRP和受体系统的激活可以引起动物的焦虑样行为。然而在羊中却得到了不同结果［46］，采用隔离束缚的心理应激方法研究发现，应激后RFRP-3蛋白和mRNA无显著变化，表达Fos蛋白的RFRP神经元数目也没有变化。但糖皮质激素显著性升高，LH明显下降。这些结果提示心理社会应激可能没有激活RFRP系统，RFRP可能不是心理社会应激引起LH变化的主要调节因子。我们实验室的研究发现妊娠期母体间歇低氧应激可以引起子代雄性大鼠的焦虑样行为，而雌性大鼠没有［47］。由于PVN是应激激活的促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)神经元主要聚集区域，同时也是RFRP神经元纤维的主要投射区域，推测RFRP与CRH存在着密切关系，RFRP可能通过调节下丘脑-垂体-肾上腺参与应激诱导的焦虑行为。

6 RFRP与应激反应

应激影响人类和动物生殖功能。许多研究显示应激轴和生殖轴有密切关系。RFRP-3作为近年发现的中枢生殖轴的调节激素，其与应激的关系也引起研究者的关注。Elizabeth等人发现在雄性成年大鼠中无论急性束缚应激还是慢性束缚应激，都可以引起DMH区RFRP的表达的上调和生殖轴活动的抑制［48］。免疫组织化学结果显示，大约有53%的RFRP细胞表达糖皮质激素受体，仅有13%的RFRP神经元表达CRH的受体。同时肾上腺切除术可以消除应激引起的RFRP的表达升高。这些研究结果表明糖皮质激素可能是应激轴中主要参与生殖抑制的激素，可以直接作用于RFRP神经元从而抑制生殖功能。另一个研究显示足部电刺激增加了下丘脑背内侧RFRP神经元的Fos蛋白表达，提示电刺激应激可以激活生殖激素RFRP神经元［44］。而给予脑室注射RFRP-1或RFRP-3可以引起血浆促肾上腺激素和催产素的增加。由于RFRP神经元纤维投射到PVN，RFRP受体也存在与这个区域，提示RFRP神经元可以激活PVN区的CRH神经元。

综上，哺乳动物的促性腺激素抑制激素(RFRP)及其受体主要分布在下丘脑，RFRP和GnRH共同参与哺乳动物生殖轴功能的调节。作为大脑的神经肽，越来越多的研究显示RFRP参与了动物的摄食、焦虑以及应激反应等行为，并起重要的调节作用。下丘脑PVN区和DMH区的促性腺激素抑制激素的网络研究将会揭示哺乳动物神经内分泌调节的核心机制，而GnRH和RFRP的相互调控机制将为动物行为神经内分泌学开拓新的研究领域。

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