布鲁氏菌脂多糖抗原纯化效果的比较

王秀丽，程君生，毛开荣，丁家波，蒋玉文

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏菌引起的一种重要的人兽共患传染性变态反应疾病，被列为《家畜家禽防疫管理条例实施细则》中二类传染病之首［1］，也是OIE规定的必须上报的传染病之一，已引起医学和兽医学界的广泛重视。布鲁氏菌的抗原组成比较复杂，其毒力与外膜中的脂多糖蛋白复合物有关已经被证实。脂多糖(LPS)是布鲁氏菌的主要毒力因子，也是主要的抗原表位。光滑型(S型)布鲁氏菌毒力明显高于粗糙型(R型)，R型布鲁氏菌表面缺乏S型的LPS，故R型为低毒或无毒株［2］，所以在检测布鲁氏菌病时主要针对光滑型致病株引起的感染。目前用于布鲁氏菌病诊断的血清学方法如酶联免疫吸附试验(ELISA)［3－4］、胶体金免 疫 层 析 法 (GICA)［5］、胶 体 金 免 疫 渗 滤 法(GIDFA)［6］、荧光偏振试验(FPA)［7－9］等都是以LPS为诊断抗原，但LPS的纯化研究报道较少，因此提高基于LPS抗原的布鲁氏菌病检测方法的稳定性和特异性，更准确确定各种检测方法所用LPS抗原的质量标准以及提高检测方法的敏感性，LPS的纯化具有十分重要的意义。

1 材料与方法

1.1 菌种与试剂 羊种布鲁氏菌16M(CVCC 70002)由中国兽医药品监察所保存。消化用蛋白酶K由Sigma公司提供。其他化学试剂均为北京化工厂分析纯产品。

1.2 方法

1.2.1 布鲁氏菌LPS抗原的粗提取 将布鲁氏菌16M的纯培养物经80℃灭活4 h后8000 g离心10 min，弃上清，加入生理盐水重悬，离心，反复洗涤3次。参照OIE手册介绍的方法［10］，取50 g湿菌体，加入170 mL蒸馏水，混匀后加热至66℃，后加入190 mL 66℃的90%(V/V)的苯酚溶液，在66℃搅拌15 min，4℃ 10000 g离心15 min，用长针头移取位于下层的酚相;加入500 mL含1%饱和醋酸钠的冷甲醇沉淀LPS，4℃沉淀2 h后10000 g离心15 min，弃去上清，沉淀中加入80 mL蒸馏水，4℃搅拌18 h，10000 g离心10 min后收集上清，沉淀中继续加入80 mL蒸馏水，4℃搅拌2 h后10000 g离心15 min，上清与前面的上清合并;在160 mL上清中加入8 g三氯乙酸，搅拌10 min后10000 g离心取上清，用蒸馏水透析，4000 mL/次，每次透析3 h，透析4次。

1.2.2 粗提取LPS的鉴定及纯度检测 粗提LPS银染鉴定。银氨染色法可以用于脂多糖的鉴定，布鲁氏菌LPS银氨染色结果在3050 kD之间有连续的棕黄色条带［4］，操作如下:将粗提取的 LPS经SDS－PAGE后，用含0.7%的高碘酸，40%无水乙醇，5%无水乙酸的固定液200 mL于22℃氧化固定20 min，用灭菌纯水漂洗3次，5 min/次;将4 mL的NH3H2O和56 mL 1.0 mol/L的NaOH与200 mL的灭菌纯水混合，逐滴加入20%AgNO3溶液10 mL，边加边搅拌，用灭菌纯水定容至300 mL，以配好的染色液染色10 min，灭菌纯水漂洗3次，5 min/次;将0.01 g的柠檬酸溶解于200 mL的灭菌纯水，加入0.1 mL 37%的甲醛溶液，用已配好的显影液显影10 min，用10%的乙酸作用1 min终止显色。LPS被染成棕黄色的连续条带。

粗提取LPS的纯度鉴定。将粗提取的LPS用琼脂糖凝胶电泳检测残留核酸，经SDS－PAGE、考马斯亮蓝染色检测残留杂蛋白。

1.2.3 粗提LPS的纯化 硫酸铵沉淀纯化法:在20 mL粗提取的LPS中逐滴加入饱和硫酸铵溶液，使得残留的杂蛋白在合适的硫酸铵浓度下析出，离心去除沉淀，用去离子水充分透析，除去硫酸铵。

冷甲醇二次沉淀纯化法:将含1%饱和醋酸钠溶液的冷甲醇逐滴加入20 mL粗提取的LPS中，边加边搅拌，至加入LPS体积的3倍，于4℃静置2 h，10000 g离心10 min，沉淀用20 mL灭菌纯水重悬。

酶消化处理纯化法:在20 mL粗提的LPS中加入终浓度15 μg/mL的核酸酶或蛋白酶K，加入核酸酶后37℃消化24 h，加入蛋白酶K后55℃消化3 h，然后室温消化24 h。用去离子水充分透析，将消化后的小分子杂质透析掉。

1.2.4 不同纯化方法的纯化效果比较 将硫酸铵沉淀法、冷甲醇二次沉淀法、酶消化处理法纯化的LPS均恢复至20 mL，用银氨染色法定性比较以上三种纯化方法纯化的LPS抗原的产率，iELISA定性比较不同纯化方法的活性，用琼脂糖凝胶电泳和SDS－PAGE鉴定LPS的纯度。

1.2.5 纯化工艺的重复性研究 选择一种较好的纯化方法，按照确定的提纯工艺分三次提取布鲁氏菌16M的LPS抗原，用银氨染色法鉴定不同批次纯化的LPS，用iELISA鉴定不同批次纯化的LPS的活性。

2 结果

2.1 布鲁氏菌LPS抗原的粗提取及鉴定 参照OIE手册制备的LPS经琼脂糖凝胶电泳检测不到核酸条带，经SDS－PAGE垂直电泳后考马斯亮蓝染色发现有杂蛋白存在(图1)，SDS－PAGE垂直电泳后银氨染色结果显示在30～50 kD处有染成棕黄色的连续条带(图2)。与文献报道的结果一致。

图1 LPS经蛋白酶K消化前后的SDS－PAGE电泳后考马斯亮蓝染色图

图2 不同批次提取LPS在消化前和消化后的银染图

2.2 LPS不同纯化方法的纯化效果比较 硫酸铵沉淀法试验结果显示由于提取的LPS中蛋白的含量较低，硫酸铵无法将其有效沉淀出来，而且由于加入较高浓度的硫酸铵，透析时会使LPS的体积大量增加，浓度降低，增加了污染的机会，需要增加一步浓缩的步骤。因此此纯化方法被放弃。

冷甲醇二次沉淀纯化的LPS SDS－PAGE电泳后考马斯亮蓝染色检测不到杂蛋白，说明纯度能满足要求，但银氨染色结果显示着色较浅(图4)，说明在纯化的过程中有大量的LPS丢失，LPS的产率不高。

粗提取的LPS鉴定结果显示无核酸残留，于是只加入终浓度为15 μg/mL的蛋白酶K消化，将消化产物透析后，考马斯亮蓝染色检测不到杂蛋白(图1)，说明LPS的纯度较高。而蛋白酶K消化前和消化后银染图显示消化过程对LPS的影响不大(图2)，消化后透析前和透析后LPS的银染结果也无明显差异，说明透析过程不会导致LPS的明显损失(图3)。

酶消化处理纯化的LPS与冷甲醇二次沉淀的LPS的活性检测采用iELISA定性分析，结果显示，酶消化处理的LPS的活性明显比冷甲醇纯化的LPS活性高(表1)，酶消化处理纯化的LPS在稀释至28时检测阳性血清的OD450mm仍较高，而冷甲醇二次沉淀的 LPS在23稀释时检测阳性血清的OD450mm值已经较低，证明酶消化处理的LPS活性比冷甲醇沉淀的活性高，且酶消化处理的整个过程LPS的活性不会降低(表1)。

综合比较各纯化方法纯化抗原的纯度、产率、活性，结果证明酶消化处理纯化LPS的效果较好。不同纯化方法纯化效果比较见表2。

表1 不同抗原稀释倍数LPS的活性分析结果(OD450mm)

表2 不同纯化阶段LPS的检测结果

表3 3批LPS不同稀释倍数活性比较(OD450mm)

2.3 LPS提纯工艺的重复性试验 参照OIE手册并根据1.2.2项试验的结论，按照确定的LPS的粗提取和纯化工艺分三次提取布鲁氏菌16M的LPS抗原，对三批抗原进行纯度和活性检测，三批LPS的银染鉴定结果见图2，三批LPS的活性测定结果见表3，试验结果证明此提纯工艺的可重复性良好。

3 讨论

本研究比较了硫酸铵沉淀法、冷甲醇沉淀法和酶消化处理法纯化LPS的效果。结果显示:因杂蛋白的含量较低，硫酸铵不能有效沉淀杂蛋白。LPS银染和活性测定结果证明冷甲醇二次沉淀纯化LPS产率较低;而酶消化处理法操作简便并且产率高;本研究定性分析了冷甲醇沉淀法和酶消化处理法纯化的LPS的活性，结果显示酶消化处理的LPS活性明显比冷甲醇沉淀的活性高，所以选择酶处理方法用于LPS的纯化。

本研究通过试验和分析，参照了OIE手册并进行了适当的改进，提纯的LPS经琼脂糖凝胶电泳后无核酸条带，SDS－PAGE电泳后考马斯亮蓝染色无蛋白条带，银氨染色在3050 kD之间有一条棕黄色连续的显色带［4－5］;按照确定的纯化工艺分三次独立提取布鲁氏菌16M中的LPS抗原，并用SDSPAGE电泳后考马斯亮蓝染色和银氨染色鉴定了LPS的纯度，用iELISA定性分析三批LPS的生物活性，试验结果证明此改良的提纯方法可重复性良好。纯化的LPS稀释3200倍仍能有效检出布鲁氏菌IgG抗体，也证明LPS抗原用于布鲁氏菌病IgG抗体的检测非常灵敏。

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