秀丽隐杆线虫作为抗感染药物筛选模型的研究进展

史秋佳，杨剑萍，陈缵光

(中山大学药学院，广东 广州 510006)

随着抗生素广泛和大量的使用，细菌对常用的抗生素出现了不同程度的耐药性，尤其是细菌多重耐药性(multidrugresistant，MDR)问题变得日益普遍［1］，同时新上市的抗生素越来越少，这种情况促使人类必须不断开发新的抗菌药物，寻找新的抗菌靶点和药物作用机制。细菌耐药性导致患者病情恶化、医疗费用增加、病死率上升，耐药菌的进一步发展可能使人类重新面临感染性疾病的威胁［2］，“遏制细菌耐药”曾成为2011年世界卫生日主题。在研发新型抗菌药的过程中诸多困难都可以通过对感染的活体动物模型研究来解决，秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)作为模式生物具有诸多优势，因而受到众多学者的关注。近年来，秀丽隐杆线虫作为模式生物被广泛应用于生物学各个领域的基础研究，其中包括病原微生物与宿主自身免疫系统的研究和新抗菌药开发。

1 秀丽隐杆线虫作为模式生物的优点

秀丽隐杆线虫是分子生物学和发育生物学研究领域的一种经典的模型动物，其作为生物模型极大地方便了生物学过程的观察［3］。早在上世纪60年代，英国科学家Brenner选择了秀丽隐杆线虫作为研究细胞凋亡遗传调控机制的简单生物模型。Brenner，Sulston和Horvitz因在研究线虫器官发育和寻找调控程序性细胞死亡过程的关键基因方面的杰出成就，分别获得2002年诺贝尔生理学或医学奖。Fire等［4］建立了线虫RNA干扰技术，目前在生命科学的许多领域得到应用，2006年，Fire和Mello因此而获得诺贝尔生理学或医学奖。

秀丽隐杆线虫作为模型动物具有以下特点和优点:①线虫长度为1 mm，♀♂同体的野生型线虫共包含959个体细胞［5］。通体透明，易观察，实验结果易放大，可在显微镜下看到线虫体内的器官如生殖腺、肠道等。由于体积小，适合放置于96孔板或者微流控芯片上进行研究，可用于高通量筛选(high throughput screening，HTS);②生死易判断，正常线虫在培养液内呈正弦运动(Fig 1)，而被细菌感染导致死亡的线虫体内充满细菌呈刚性杆状(Fig 2)，仅用肉眼即可判断线虫生死;③易培养，它以大肠杆菌OP50为食，在20℃琼脂平板培养。线虫拥有复杂的化学感受系统，可以感受并反应于许多化学成分。Beale等［6］的实验显示，秀丽隐杆线虫可以利用细菌产生的气味辨别食物源。并且，线虫能够在液体培养基中生存，这为高通量筛选带来便利;④繁殖快，在实验室20℃条件下，线虫从受精卵发育为成虫仅需3.5 d，平均寿命为3周，可缩短实验过程的时间。多产，一条未经交配的雌雄同体线虫在其生殖期可产生大约300个受精卵;⑤与人类同源基因多，与人类疾病具有相关性［8］。由线虫的中央数据库wormbase(http://www.wormbase.org/)可知，现已知的秀丽隐杆线虫药靶基因与人类基因同源性达60%～80%［7］。由于线虫和人类在许多基因和生物机制方面的高保守性，使线虫成为体内药物筛选的优秀模型。

Fig 1 Living nematodes maintain a sinusoidal shape

Fig 2 Dead nematodes appear as straight，rigid rods

2 研究进展

2.1秀丽隐杆线虫感染模型的建立细菌致病机制和线虫防御机制的研究是利用线虫模型开发抗菌药物的基础和前提。作为一种简单的模式宿主，线虫可被多种人类病原菌感染和杀死。目前已利用线虫作为模式生物研究的病原体有革兰阳性菌金黄色葡萄球菌［9］、粪肠球菌［10-11］、李斯特菌［12］，革兰阴性菌铜绿假单胞菌［13-14］、沙门菌［15］等。

耐药铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)是常见的院内感染致病菌。通过制备耐药铜绿假单胞菌感染秀丽隐杆线虫平板，周雨朦等［16］建立线虫-耐药铜绿假单胞菌感染模型，并且在感染线虫救治实验中发现，可以排除毒性高、体内外相关性差的化合物，线虫感染模型适合用于筛选抑制耐药菌生长和繁殖的化合物。陈丽红等［17］建立了铜绿假单胞菌-线虫感染模型，确立了最佳操作参数，并且研究了不同抗生素对线虫存活时间的影响，得出了线虫感染程度可量化操作的结论。

2.2利用秀丽隐杆线虫感染模型研究细菌致病机制和线虫免疫机制早期研究中，Garsin等［10］采用线虫作为宿主模型来识别革兰阳性细菌的毒力因子。作为对人类有致病性的革兰阳性肠球菌，粪肠球菌(enterococcus faecalis)和屎肠球菌(enterococcus faecium)被用来做初步毒力鉴定。因为粪肠球菌和屎肠球菌都可以杀死线虫的卵和幼虫，然而如鼠伤寒沙门氏菌等革兰阳性菌病原菌的致病性都没有强到可防止线虫下一代的孕育。由于缺少对后代的干扰，粪肠球菌和屎肠球菌简化了线虫作为宿主的病原菌研究。对于成虫，粪肠球菌可以在线虫肠内繁殖达更高的滴度，导致持续的感染，并最终导致线虫死亡。高滴度的屎肠球菌也可以在线虫的肠内累积，但是却不会影响成虫的寿命。他们采用了粪肠球菌感染线虫模型，发现了两个粪肠球菌毒力相关因子:tsr和ScrB。

金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)，作为革兰阳性菌的代表，也同样被用于建立秀丽隐杆线虫的感染模型中。Sifri等［19］建立了金葡菌感染线虫的模型，他们将线虫放置在金葡菌环境中，几天后线虫死于消化道中金葡菌的增殖。由此，他们推测金黄色葡萄球菌毒力因子，例如agr和sarA，是一些哺乳动物发病的关键因素，并且一些缺失某些功能的线虫突变体会对金黄色葡萄球菌易感。Irazoqui等［14］则拓展了Sifri等［18］的工作，研究了铜绿假单胞杆菌和金黄色葡萄球菌分别感染线虫时不同的致病机制和宿主反应。他们发现铜绿假单胞杆菌缓慢侵占线虫肠道，产生与毒力因子相关的囊泡，并且在肠道细胞累积高电子密度生物被膜样物质，使肠道细胞变异。与此相反，金黄色葡萄球菌感染迅速，破坏微绒毛，溶解宿主细胞。线虫被金黄色葡萄球菌感染时，会产生解毒反应，尽量延长宿主的生存，这点和人类被金葡菌感染时的反应相似。有些细菌经热灭活后，就失去了对于线虫的致死性，但他们发现热灭活的金葡菌可以感染线虫，机制是金黄色葡萄球菌通过分泌出的有溶血活性的热抵抗毒力因子使线虫死亡。

McEwan等［19］发现了铜绿假单胞菌触发秀丽隐杆线虫肠道天然免疫力的分子机制。线虫缺少专门的免疫细胞，因此肠道上皮细胞(IECs)完全充当了线虫抵御铜绿假单胞菌的主要防御系统，当铜绿假单胞菌PA14积累在线虫肠脏处时，可以引发宿主的机体损伤或抗微生物相关基因的表达量增加。ToxA(外毒素A)是90%以上临床铜绿假单胞菌所表达的一种细菌毒素，当线虫感染铜绿假单胞菌后，ToxA可以抑制线虫体内的蛋白质合成，他们通过一些研究证据证实了秀丽隐杆线虫可以通过检测并且识别ToxA介导的翻译抑制剂来识别ToxA毒素，这种识别能力可以激活蠕虫体内部分依赖于免疫系统的潜在的转录应答，而且可以激活诸如ZIP-2、PMK-1、MAPK、FSHR-1等抵抗铜绿假单胞菌感染的免疫能力。该研究阐释了线虫可通过识别铜绿假单胞菌的ToxA激活一系列免疫系统基因的表达来抵御铜绿假单胞菌的感染。

近年来，线虫模型的发展推进了我们对于一些感染类疾病发病机制的理解，而对疾病本质的深刻认识自然会为感染类疾病的治疗提供启示，同时也大大加速了新型抗生素的发现。Ewbank等［20］综述了一些种族抗菌肽和蛋白质，可作为候选新型抗生素。并且阐述了线虫感染系统提供新型抗生素大规模体内筛选的可能性。这些发现为新型抗菌疗法提供了广阔前景。

2.3利用秀丽隐杆线虫感染模型研究新型抗菌药物作用机制减弱细菌的毒力是抗菌药物的研发的一个靶点，Ho等［21］通过感染秀丽隐杆线虫研究发现，内分泌药物雷洛昔芬可以强烈地抑制铜绿假单胞菌的毒力产生。使用该药物对野生型铜绿假单胞菌作用，结果表明细菌产生的绿脓菌素水平明显降低了。这些结果揭示了雷洛昔芬这种传统用于预防和治疗绝经后妇女的骨质疏松症的内分泌药物或许可以用于开发出新型的疗法来靶向治疗铜绿假单胞菌的感染，这可能是细菌感染患者的一大福音。

近年关于铜绿假单胞菌中拮抗细菌群体感应(quorum sensing，QS)系统的研究已成为学者们的研究热点。以抑制QS系统为靶标的分子抑制物，可以用于开发新的抗菌药物。Sarabhai等［22］首次报道利用秀丽隐杆线虫模型研究发现诃子果实中的鞣花酸衍生物具有拮抗QS系统，从而阻断细菌细胞之间信号传递的作用。其机制为，下调QS系统中两个重要基因lasIR和rhIIR的表达，并同时减少了革兰阴性菌的信号分子AHL的表达，最终导致铜绿假单胞茵PAO1野生型的毒力的减弱并且提高了其生物膜对妥布霉素的敏感。

2.4利用秀丽隐杆线虫感染模型筛选抗菌药物的进展随着越来越多耐药菌株出现，新型抗菌化合物的发现速度相对变慢，化合物库中很多物质毒性大、体内代谢差，而这些问题都可通过活体生物感染模型筛选来克服。线虫能够提供相对完整的实验动物模型，又可避免小鼠模型的高价、耗时的缺点，因此可大幅降低药物筛选的成本，是用于大规模药物筛选的理想系统，近年来越来越多地受到科学家们的青睐。

Moy等［23］首次建立粪肠球菌感染的秀丽隐杆线虫体内抗菌药物筛选模型。他们采用琼脂板培养线虫，在96孔板上进行筛选操作，筛选了1 136种天然产物和6 000种合成化合物，发现16种化合物和9种提取物可延长被粪肠球菌感染的线虫的寿命。他们发现筛选出的天然化合物中至少有2种物质体外抗粪肠杆菌效果很差但是体内有效;有些化合物体内有效抑菌浓度可比体外有效抑菌浓度低很多;16种化合物中15种显示无毒，有1种化合物可造成线虫发育延迟。

虽然他们利用线虫活体筛选抗菌化合物的试验方法具有很多先进性，但是也有一些缺点，有很多重复性的人工操作，需要肉眼通过显微镜观察判断线虫是否死亡，会耗费较多人力和时间。Moy等［24］随后对方法进行了改进，建立了更加微型化和全自动化的384孔板采集分析的高通量筛选系统。该系统主要由两个设备组成:复杂对象分类筛选系统COPAS(complex object parametric analyzer and sorter)Biosort和自动图像获取处理系统。使用这个系统，他们筛选了共计37 000个化合物和天然提取物，发现了28种未被报道过的具有抗菌活性的化合物，其中有6种化合物在体外不影响病原菌的生长，说明它们可能阻止细菌毒力因子或是增强线虫免疫功能，这和临床上使用的抗生素具有完全不同的机制。他们的筛选流程如下:(1)用粪肠球菌感染同步化处理过的无菌成年线虫;(2)将液体培养基分配至384孔板中;(3)利用COPAS Biosort将每个孔放置15条感染过的线虫;(4)在26.3℃相对湿度85%条件下孵化5 d;(5)为了避免细菌干扰染色，用BioTek ELx405微孔清洗器洗去培养液中的细菌;(6)每个孔都加入SYTOX黄进行死细胞染色，只会染色死亡线虫;(7)用MD Discovery-1自动显微镜获取图像;(8)用CellProfiler系统分析计算线虫成活率。

Okoli等［25］建立了一个线虫–白色念珠菌感染模型的高通量筛选抗真菌药物系统。该系统可自动将白色念珠菌感染线虫，并精确将线虫分配到384孔板的孔中，省去了两个相对耗费人工的步骤。他们利用这个系统筛选了1 948种生物活性化合物和通过多样性合成的1 280种小分子化合物，发现了19种化合物具有抗真菌活性。其中7种是临床已使用于抗真菌的药物，12种未被用作抗真菌药物，这12种新化合物中有3种是免疫抑制剂。

杨再昌等［26］采用铜绿假单孢菌、金黄色葡萄球菌分别感染的秀丽隐杆线虫模型，筛选了43种中药的体内抗菌疗效，发现8种中草药提取物在浓度为1 600 mg·L-1时均无体外抗菌活性，但是较低浓度(100～800 mg·L-1)时对线虫产生会体内抗菌作用。在抗生素遭遇限制使用的情况下，使用中草药来治疗感染性疾病或将成为主流。

本课题组已经开始基于微流控芯片的秀丽隐杆线虫药物筛选研究［27-28］，开发了一种新颖的微流控芯片装置用于抗菌药物筛选。采用常见的致病菌——金黄色葡萄球菌，作为病原菌去感染线虫。致力于建立一种在线的全液体感染方法，得以在芯片上完成整个感染实验。本方法相比传统的感染方法，其明显的优势体现在:液体的感染方法可以极大地简化线虫在不同培养板上反复接种、清洗和转移等实验程序，大大提高了实验的效率［29］。

以上的研究表明，利用秀丽隐杆线虫感染模型筛选抗感染药物有体外药物筛选所不具备的优势:(1)可以发现体外没有抗菌活性但是有体内活性的化合物，包括先导化合物，作用于致病菌毒力因子或者增强宿主免疫力的化合物;(2)由于判断化合物是否有效是以线虫是否死亡为标准，所以减少了大规模化合物筛选时筛选出有毒化合物或者体内药代动力学参数不佳导致的无效的化合物;(3)可以发现一些机制新颖、辅助抗感染的化合物。

3 总结和展望

当前细菌耐药性的迅速上升和新抗菌药的不断减少形成了鲜明对比，新型抗菌药物研发进入了瓶颈阶段，开发新型抗菌药物已成为当前医药界一个十分紧迫的任务。世界卫生组织也呼吁各国政府和研究人员加大资金投入，加强能替代现有抗生素的新药开发。传统的动物模型，由于其存在时间长、操作繁琐及费用高等缺点，在如今新抗菌药物研发压力下并不能很好的适应整个研发环境的节奏。秀丽隐杆线虫模型为筛选抗菌药物提供了更好的平台，为促进新抗菌药的探索提供了一个更方便的工具。尽管线虫与人类基因具有高度保守性，作为模型动物在抗菌药物的体内研究中表现出强大的优势，但毕竟线虫和人类在生理、病理等方面差异较大，线虫不具备完整的循环系统、呼吸系统、获得性免疫系统，所以它不能完全代替其他哺乳动物模型进行药物研究。由于线虫无法在37℃下生存，所以限制了可研究的病原菌范围。此外，线虫具有强大的解毒系统，这依赖其细胞色素P450基因，这也限制了一些调节宿主防御的一些化合物的发现。目前秀丽隐杆线虫模型在抗感染药物筛选方面只能局限于初筛，新药的发现还需要后续的动物试验和临床试验。我们应当正确认识秀丽隐杆线虫在研究抗感染药物方面的优势和不足，进行周密的实验方案设计，确证线虫病理模型与人类病理某一方面的一致性，才能充分发挥线虫模型这个体内抗感染药研究和体外抗感染研究这座桥梁的价值。

秀丽隐杆线虫作为优秀的模型动物除了用于抗菌药物的体内研究，还被广泛应用于人类疾病模型的复制与干预、药物新靶点的发现与证实、基因组学、毒理学、神经生物学、遗传与发育生物学、环境生物学等领域。可以预见，随着人们对秀丽隐杆线虫认识的不断加深，这种小型的模型动物将在药学领域发挥出更大的作用，为新药的发现增加新的途径。

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