BRAF突变的黑色素瘤耐药机制研究进展

刘兆国，范方田，韦忠红，王爱云，陈文星，郑仕中，2，陆 茵，2

(1.南京中医药大学药学院，2.江苏省中药药效与安全性评价重点实验室，江苏南京 210046)

近年来，恶性黑色素瘤(malignant melanoma，MM)的发病率不断上升，给人类的健康带来了巨大的威胁［1］。本病的特点是发病早期的转移率高、致死性强，对单纯放化疗敏感性差，患者大多预后不良。研究人员通过对黑色素瘤患者肿瘤细胞的基因突变进行大量研究发现，约50%的晚期黑色素瘤患者中发生了BRAF(V600E)突变，在一些研究中其突变率甚至高于60%［2］。目前，临床上已批准的用于治疗BRAF突变黑色素瘤的靶向药物(如 ipilimumab［3］和vemurafenib［4］)对黑色素瘤患者有很高的疗效，与放化疗相比能够明显延长无进展生存期和总生存期，但这些药物在体内所产生的效应是短暂的［5］，大多数患者在不到1年内就产生了耐药。针对BRAF突变黑色素瘤耐药的现状，近几年来科研人员投入了更多的精力在耐药机制的研究上，并获得了许多重要的发现。本文着重对近年来BRAF突变黑色素瘤耐药机制的研究概况进行综述，探讨临床黑色素瘤治疗的策略，以期为BRAF突变黑色素瘤耐药的后续研究及临床治疗提供重要的参考。

1 BRAF的突变促进了细胞的增殖和肿瘤的侵袭转移

BRAF是RAF激酶家族的3个主要成员(ARAF、BRAF、CRAF)之一，该蛋白是由3个保守结构域(CR)组成［6］。临床研究发现BRAF在RAF家族的3个亚型中突变频率最高。大约7%～8%的人类肿瘤中出现了BRAF突变，而在黑色素瘤中BRAF突变率大约在60%左右［2］。在黑色素瘤中，BRAF基因突变导致编码氨基酸的改变，可以通过模拟T598和S601两个位点的磷酸化从而造成BRAF激酶的持续性活化［2，7］，激活下游的信号传导通路(如 MAPK 和 MEKERK等)［8］，从而促进细胞的增殖和肿瘤的侵袭转移，导致肿瘤细胞无限制的生长。

2 BRAF抑制剂治疗黑色素瘤耐药性的获得是临床治疗面临的最为棘手问题

目前，临床上对于BRAF突变黑色素瘤主要采用BRAF靶向抑制剂来进行治疗。2011年，首个BRAF(V600E)靶向抑制剂威罗菲尼［9-12］被FDA批准上市。威罗菲尼是选择性BRAF(V600E)抑制剂。临床前实验证实，它能选择阻断RAF/MEK/ERK通道的BRAF突变黑色素瘤细胞，并引起BRAF突变的异体移植物缩小［13］，一般用于检出有BRAF(V600E)突变的、不可切除的或转移的黑色素瘤的治疗。临床研究发现，威罗菲尼不但能够大大提高BRAF(V600E)突变的晚期黑色素瘤患者的反应率，同时能够明显延长BRAF(V600E)突变黑色素瘤患者的无进展生存期和总生存期［14-16］。然而，尽管在黑色素瘤的治疗过程中，威罗菲尼起效快速，疗效确切，但临床研究发现其疗效维持时间通常仅为8～9个月，患者很快就出现耐药，耐药后的黑色素瘤又可以重新快速生长。那么BRAF(V600E)突变黑色素瘤出现耐药性的机制究竟是什么呢?

3 BRAF突变黑色素瘤耐药的分子机制

针对BRAF突变黑色素瘤耐药的现状，同时也为了更好的使用BRAF靶向抑制剂，近年来科研人员将更多的精力投入在对其耐药机制的研究上，并获得了许多重要的发现。总结起来主要有以下几种耐药机制:

3.1BRAF自身缺失突变介导耐药的产生在威罗菲尼耐药细胞中鉴定出了BRAF(V600E)的一种61 ku突变形式:p61BRAF(V600E)。p61BRAF(V600E)虽然缺失RAS结合结构域，且细胞中RAS活性较低，但是p61BRAF(V600E)与BRAF(V600E)相比，二聚体形成能力增强，可重新激活ERK信号，导致细胞对BRAF(V600E)抑制剂耐药。这一实验结果同样在耐药黑色素瘤患者样本上得到验证［17］。

3.2肿瘤微环境中高HGF介导耐药的产生肿瘤微环境是由肿瘤细胞和多种基质细胞、细胞因子、趋化因子等组成，可促进肿瘤细胞的生长和转移，并影响肿瘤细胞对药物的敏感性［18-20］。Straussman 等［8］通过免疫组织化学方法证实BRAF突变黑色素瘤患者的间质细胞能够表达HGF，并且发现由间质细胞分泌的HGF与患者对RAF抑制剂耐药之间存在明显的相关性。研究还发现，同时抑制RAF和HGF或者同时抑制RAF和MET(HGF的受体)都能够逆转RAF靶向抑制剂的耐药。进一步的研究证实，在肿瘤微环境中，基质成纤维细胞分泌的HGF是通过激活其受体c-Met，继而活化下游的PI3K/AKT及MAPK［21］信号通路，从而引起患者对多种靶向药物的耐药。

3.3COT/Tpl2过表达介导耐药的产生Johannessen等［22］在A375黑色素瘤细胞中稳定表达597种激酶的开放阅读框，观察威罗菲尼对细胞的 pMEK抑制变化，发现CRAF和COT能抵抗威罗菲尼对pMEK的抑制。在对BRAF(V600E)抑制剂耐药的细胞、获得性耐药的肿瘤细胞和患者组织中，均能检测到COT蛋白表达增加。COT是一种非RAF依赖途径中的MEK磷酸激酶，可激活MEK蛋白，但获得这种抵抗途径的细胞对MEK抑制剂并不敏感。产生这种情况的原因可能是由于COT激活过量的MEK，严重超出ERK的磷酸化载量，最终导致ERK处于持续被激活的状态，进而介导黑色素瘤耐药的产生。

3.4NRAS的激活突变介导耐药的产生RAF作为RASRAF-MEK-ERK通路中的一个关键激酶，可以通过依赖和不依赖RAS的方式发挥其对信号传导及调节作用。在体外诱导的威罗菲尼耐药细胞中发现了高活性的NRAS突变，并且其pMEK和pERK水平没有被抑制。同时，在威罗菲尼耐药的黑色素瘤患者转移的淋巴结中，也同样发现了突变激活的NRAS［23］。NRAS突变的黑色素瘤对 MEK抑制剂敏感，提示突变所致NRAS重新激活了MAPK通路，进而导致了肿瘤细胞对靶向抑制剂的耐药。

4 未来临床针对BRAF突变黑色素瘤的治疗策略

临床应用BRAF抑制剂很快出现耐药，这提示我们单独的应用BRAF抑制剂已不足以有效的抑制黑色素瘤的生长。针对这种情况，临床上该采取怎样的治疗策略才能有效的治疗黑色素瘤呢?首先，通过分析肿瘤相关成纤维细胞分泌的HGF介导的黑色素瘤靶向药物耐药的机制发现，针对此种机制的耐药治疗的策略可以分为两种:一，针对黑色素瘤细胞HGF/Met信号，联合应用RAF抑制剂和Met抑制剂。目前Met抑制剂类药物已处于临床前和临床研究阶段［8］，有望成为HGF介导的黑色素瘤靶向药物耐药的临床一线药物。二，针对黑色素瘤相关成纤维细胞，如抑制黑色素瘤相关成纤维细胞的增殖、活化和分泌等，同样可以有效逆转药物的耐药。其次，针对临床上BRAF突变黑色素瘤均能检测到COT蛋白表达增加，并导致ERK处在持续被激活的状态，我们可以通过联合应用COT抑制剂，从而使ERK的磷酸化载量始终处于不超载状态，这样就能够有效的控制耐药的发生。

5 小结

目前，BRAF(V600E)抑制剂与其他激酶抑制剂(如MEK、PI3K、AKT、mTOR、PTEN 等)相关的临床试验正在进行当中。我们在等待临床试验结果的同时，还需要继续深入研究BRAF突变黑色素瘤的耐药机制，寻找反映肿瘤耐药的相关marker，以便于更早更及时准确的预防耐药性的产生。威罗菲尼因其对BRAF(V600E)突变的高选择性而对BRAF(V600E)突变的黑色素瘤效果明显，然而也正因为其靶标的专一性，使其对机体的相关代偿作用没有作用。联合应用靶向抑制剂治疗，由于同时靶向多个激酶分子或多条信号通路，不仅降低了各自的毒副作用，同时还有效地预防或延缓耐药性的产生，从而更好的达到抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡的目的，明显提高治疗效果。

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