夏枯草水提液对人甲状腺细胞NO生成及其与摄碘率相关性影响

刘新宇， 刘春娜， 郑久明

（1.辽宁医学院附属第一医院，辽宁锦州121001；2.辽宁医学院药理学教研室，辽宁锦州 121001）

夏枯草水提液对人甲状腺细胞NO生成及其与摄碘率相关性影响

刘新宇1， 刘春娜2*， 郑久明2

（1.辽宁医学院附属第一医院，辽宁锦州121001；2.辽宁医学院药理学教研室，辽宁锦州 121001）

目的 旨在观察中药夏枯草水提液对人甲状腺细胞一氧化氮 （NO）生成、摄碘率及钠/碘转运体 （NIS）表达的影响，探讨其增强甲状腺细胞碘摄取的分子机制。方法 选用人甲状腺腺瘤旁正常甲状腺组织，采用细胞原代培养方法及半定量逆转录聚合酶链反应 （RT-PCR）技术，观察夏枯草水提液对体外培养人甲状腺细胞NO生成、碘摄取及NIS表达的影响。结果 经促甲状腺激素 （TSH）（200 μIU/mL）处理的人甲状腺细胞，夏枯草水提液抑制其NO的生成，增强碘的摄取及NIS的表达，其中夏枯草 （100 g/L）作用最强，并且后二者呈正相关 （r=0.88）。结论

目前，中药夏枯草在临床上主要用于治疗甲状腺肿大、瘰疬、淋巴结核、瘿瘤、乳痈、肺结核、乳癌、筋骨疼痛、急性传染性肝炎等。临床上用夏枯草治疗甲状腺疾病已有久远的历史，夏枯草可辅助治疗甲状腺功能亢进、亚急性甲状腺炎、桥本氏甲状腺炎、单纯性甲状腺肿和甲状腺功能减退［1］，在细胞水平夏枯草可促进甲状腺癌细胞凋亡［2］，增加甲状腺癌细胞碘的摄取及钠/碘转运体 （NIS）的表达［3］，但夏枯草与甲状腺细胞碘摄取之间的关系尚缺乏进一步的探讨。本实验主要观察夏枯草对体外培养人甲状腺细胞碘摄取的影响，验证该作用与一氧化氮 （NO）是否相关，探讨其对甲状腺细胞碘摄取影响的分子机制。

1 实验材料

1.1 甲状腺组织取材方法及实验分组 甲状腺腺瘤旁正常的甲状腺组织 （辽宁医学院附属第一医院手术室提供）。

1.2 夏枯草水提液配制 40 g夏枯草加蒸馏水400 mL，煮沸30 min后过滤除渣，熬制成浓缩液并定容至40 mL，滤液浓缩质量浓度为1 g/mL，经120℃ 30 min高压灭菌，用直径为22 μm的微孔滤膜正压过滤。按药物质量浓度分为4个质量浓度组 （0、50、100、200 g/L）。

1.3 试剂与仪器 牛TSH、F-12培养基：Sigma公司；MMLV：Promega公司；NO检测试剂盒：南京建成生物公司；GibcoBRL公司；Trizol试剂：Na125I：由中国人民解放军205医院同位素科惠赠。

2 方法

2.1 甲状腺细胞培养 手术中剥离甲状腺腺瘤旁正常甲状腺组织，以无钙镁Hank's液冲洗2次，剪碎。0.25% 胶原酶消化和0.25% 胰酶60 min，1 200 r/min离心10 min，将离心后的沉淀物制成细胞悬液，悬于含有15%胎牛血清和200 μIU/mL促甲状腺激素 （TSH）的F-12培养液当中。采用台盼蓝染色证明活细胞＞95%，调整细胞数 （5×105）并接种于培养瓶，37℃，CO2孵箱中培养，48 h换液。

2.2 测定NO 将甲状腺细胞接种于24孔培养板，贴壁生长72 h，加入夏枯草 （0、50、100、200 g/L），各药物质量浓度接种8复孔，硝酸还原酶法，550 nm处测定吸光度值。观察经夏枯草孵育 （24 h、48 h、72 h）后对NO产生的影响。

2.3 碘摄取率的测定 将甲状腺细胞细胞接种于24孔培养板，贴壁生长 72 h，加入夏枯草 （0、50、100、200 g/L），各药物质量浓度接种8复孔，孵育24 h，用1 mL冷HBSS漂洗2次。10 μmol/L的KI，内含0.000 5 mL Na125I（15 000 cpm），37℃，水浴40 min，冰的HBSS漂洗2次。加入0.5 mL HBSS（内含20 mmol/L KClO425 μL），37℃，30 min后γ-记数器记数。观察经夏枯草孵育 （24 h、48 h、72 h）后对碘摄取率的影响。

2.4 NIS mRNA检测 采用半定量RT-PCR方法进行检测。将上述细胞置于含夏枯草 （0、50、100、200 g/L）中，孵育24 h，Trizol试剂提取总 RNA。以逆转录酶 （M-MLV）进行逆转录，β-actin：顺 5'-TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA-3'， 反 5'-CTAGAAGCATTGCGGTGGACGATGGAGGG-3'，PCR引 物 NIS：5'-CTCCCTGCTAACGACTCCAG-3'，反 5'-AACAGACGATCCTCATTGGTG-3'，扩增片段长度分别为392 bp及661 bp。PCR的反应条件为97℃ 5 min、93℃ 3 min，预变性，93℃ 45 s、55℃ 45 s、72℃ 45 s，共计30个循环，72℃ 7 min末循环。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶 （含溴乙锭）进行电泳，以100 bp ladder DNA为标志物，结果用Kodak Digital 1D Image A-nalysis Software成像系统扫描，测定各组光密度值，计算NIS/β-actin光密度比值。观察经夏枯草孵育 （24 h、48 h、72 h）后对NIS mRNA表达的影响。

2.5 统计学处理 应用SPSS 18.0统计软件，数据以均数±标准差 （±s）表示。两组平均值比较采用非配对t检验。两组以上均值的比较采用随机设计方差分析q检验。P＜0.05为具有显著性差异，P＜0.01为差异极显著。

3 实验结果

夏枯草水提液 （50、100、200 g/L）体外培养能够显著抑制人甲状腺细胞产生NO，增强甲状腺细胞碘摄取，同时增强人甲状腺细胞NIS mRNA的表达，其中100 g/L质量浓度的作用最强 （表1），可显著抑制甲状腺细胞产生NO，呈时间依赖性，孵育48 h对于增强碘的摄取及NIS mRNA表达最显著 （表2）。经对培养人甲状腺细胞碘摄取与对NIS mRNA表达的影响进行相关性分析，二者呈正相关（r=0.88）。

表1 不同质量浓度夏枯草水提液对培养人甲状腺细胞NO、摄碘率和NIS表达的影响

表2 夏枯草水提液不同时间对培养人甲状腺细胞NO、摄碘率及NIS表达的影响

4 讨论

夏枯草是临床经典的治疗甲状腺疾病的辅助中药，能增强甲状腺癌细胞碘的摄取及NIS的基因表达［3］，但其作用机制尚无报道。NO已被确认是甲状腺细胞及各组织内重要的信息分子，参与多种甲状腺生理及病理过程，本实验室已研究证实NO能抑制体外培养甲状腺细胞碘摄取、NIS mRNA表达、碘有机化以及介导脂多糖 （LPS）对NIS的影响［6，9-11］。

本实验显示夏枯草可以抑制体外培养人甲状腺细胞NO的产生，提高细胞对碘的摄取，增强NIS mRNA的表达，并呈正相关 （r=0.88），结果提示夏枯草提高甲状腺细胞的碘摄取，其可能的机制是由其增强NIS mRNA的表达，而通过抑制甲状腺细胞NO的产生发挥作用。NIS受到多种因子的调控，如促甲状腺维激素、全反式维甲酸、环磷酸腺苷 （cAMP）等可以上调NIS的表达，高碘、某些细胞因子及糖皮质激素等则起到下调的作用［12］。某些细胞因子如IL-α及IL-β能够刺激人甲状腺细胞内诱生性一氧化氮合酶（iNOS），其作用强而持久的NO［13］，这些细胞因子抑制碘摄取可能是通过NO介导，而夏枯草是否能抑制NOS仍需进一步探讨。研究表明，NO发挥其主要病理生理作用，是通过激活甲状腺细胞鸟苷酸环化酶介导的cGMP生成这条途径来实现［4］，研究也发现，cGMP类似物能抑制牛甲状腺细胞碘的摄取［14］。甲状腺细胞对碘的摄取是通过Na+-K+-ATP酶提供能量，NO已被证明能抑制甲状腺细胞膜Na+-K+-ATP酶的活性［6］，夏枯草对 Na+-K+-ATP酶的影响尚待进一步证明。当然，夏枯草对甲状腺细胞碘摄取的影响可能存在多种机制，但NO在其中必定起重要作用。总之，深入研究夏枯草与甲状腺之间的内在联系将有助于进一步了解其药理作用，为临床治疗甲状腺相关疾病提供更为丰富的理论基础。

［1］吴胜本.夏枯草口服液在Graves病治疗中的应用［J］.中成药，2012，34（1）：10-11.

［2］张 静，王 瑛，赵华栋，等.中药夏枯草对人甲状腺癌细胞系SW579增殖周期及凋亡的影响［J］.现代生物医学进展，2011，11（23）：4434-4436.

［3］张王峰，付 强，赵华栋，等.中药夏枯草对甲状腺癌细胞NIS基因表达及摄碘率的影响［J］.第四军医大学学报，2008，29（9）：826-828.

［4］Esteves R Z，van Sande J，Dumont J E.Nitric oxide as a signal in thyroid［J］.Mol Cell Endocrinol，1992，90（1）：R1-R3.

［5］Bazzara L G，Vélez M L，Costamagna M E，et al.Nitric oxide/cGMP signaling inhibits TSH-stimulated iodide uptake and expression of thyroid peroxidase and thyroglobulin mRNA in FRTL-5 thyroid cells［J］.Thyroid，2007，17（8）：717-727.

［6］刘新宇，刘春娜，刘用璋，等.一氧化氮对人甲状腺细胞钠-碘转运体的影响［J］.中国地方病学杂志，2004，23（3）：207-210.

［7］张丽丹，苏 洁，吕圭源，等.夏枯草的药理研究与临床应用［J］.海峡药学，2011，23（5）：143-145.

［8］顾晓洁，钱士辉，李友宾，等.夏枯草的化学成分及药理作用研究进展［J］.中国野生植物资源，2007，26（2）：5-7.

［9］刘新宇，刘春娜.一氧化氮对人甲状腺细胞钠/碘转运体的基因调节作用［J］.中国药房，2010，21（1）：28-29.

［10］刘新宇，刘春娜，刘用璋，等.一氧化氮供体硝普钠对人甲状腺细胞碘有机化的影响［J］.中华内分泌代谢杂志，2006，22（2）：147-148.

［11］刘新宇，刘春娜.脂多糖对人甲状腺细胞钠/碘转运体的基因调节作用［J］.广东医学，2009，30（12）：1788-1789.

［12］Dohán O，De la Vieja A，Paroder V，et al.The sodium iodide symporter（NIS）：characterization，regulation，and medical significance［J］.Endocr Rev，2003，24（1）：48-77.

［13］van den Hove M F，Stoenoiu M S，Croizet K.et al.Nitric oxide is involved in interleukin-lα induced cytotoxicity in polarised human thyrocytes［J］.J Endocrinol，2002，173（1）：177-185.

［14］Costamagana M E，Cabanillas A M，Coleoni A H，et al.Nitric oxide donors inhibit iodide transport and organificafion and induce morphological changes in cultured bovine thyroid cells［J］.Thyroid，1998，8（12）：1127-1135.

R285.5

B

1001-1528（2013）05-1065-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2013.05.049

2012-08-30

辽宁省科学技术计划项目 （2010225034），辽宁省教育厅创新团队项目 （LT2010065）

刘新宇 （1976—），男，副教授，硕士，研究方向：中药内分泌。Tel：13504064376

*通信作者：刘春娜 （1977—），女，副教授，博士，研究方向：神经药理学。Tel：（0416）4673465，E-mail：springnanaliu@163.com夏枯草水提液能抑制甲状腺细胞NO生成，提示增强甲状腺细胞碘的摄取是通过抑制NO合成来实现的。关键词：夏枯草；水提液；甲状腺细胞；一氧化氮；钠/碘转运体；摄碘率；促甲状腺激素