中国朝鲜族人群MDR1基因多态性与环孢素A谷浓度的相关性研究

唐哲，孙玉坤，杨媛媛，何伟，张敬一（.武警辽宁省总队医院药剂科，沈阳 004；.沈阳市苏家屯区中医医院药剂科，沈阳 00；.沈阳军区总医院药剂科，沈阳 006）

环孢素A（Cyclosporine A，CsA）为免疫抑制剂，是由11个氨基酸组成的中性环状多肽，属钙调磷酸酶抑制剂家族。有报道[1]指出，CsA在药动学、毒理学、敏感性和耐受性等方面存在着明显的个体差异，而且治疗指数较窄，引起这种差异的原因目前尚不十分清楚。临床上，监测免疫抑制剂的药物浓度，可以更好地调整药物使用剂量，以及减少药品不良反应发生。CsA的体内药物浓度和治疗效果存在相关性[2]，因此，临床上对其血药浓度监测是十分必要的。

P糖蛋白（P-gp）是由多药耐药基因（MDR1）编码的一种产物，是一个膜蛋白，属三磷酸腺苷（ATP）结合家族。P-gp主要作用为能量依赖性地将作用底物由细胞膜内转运至细胞膜外，起跨膜渗透泵的作用。当P-gp活性增加时，底物将大量被转运至膜外，反之亦然。现有文献提示MDR1基因具有48个单核苷酸多态性（SNP），其中，有重要的功能意义的为第26外显子C3435 T位点上的基因多态性，且不同种族间差异较大[3]。近年来，有关C3435 T基因多态性与CsA体内代谢的相关性的报道已有很多，但有关中国朝鲜族肾移植术后患者CsA谷浓度与MDR1C3435 T位点的基因多态性之间的关联性尚无报道。本文以75例肾移植术后患者（中国朝鲜族）为探讨对象，采用聚合酶链反应（PCR）扩增MDR1 C3435 T基因，利用DNA限制性片段长度多态性（Restriction fragment length polymorphism，RFLP）方法检测了C3435 T的多态性，并探讨了CsA的谷浓度与MDR1 C3435 T基因位点多态性之间的相关性，希望为临床个体化用药提供依据。

1 材料

1.1 仪器

ABI 2720 PCR扩增仪、紫外凝胶成像系统（Gene Company）；TDxFLx/TDx免疫分析仪（珠海健民医用科技有限公司）；Eppendorf 5804 R冷冻离心机（Gene Company）；DYY-6 C电泳仪（上海笛柏实验设备有限公司）；HH-S恒温水浴锅（郑州佳创仪器设备有限公司）；V-32涡旋混合器（上海凌初科学仪器有限公司）。

1.2 药品与试剂

提取基因组DNA试剂盒（广州健仑生物科技有限公司）；引物（广州健仑生物科技有限公司）；限制性内切酶MboI与Taq酶（郑州博美生物技术有限公司）；硼酸（优级纯，国药集团化学试剂北京有限公司）；琼脂糖凝胶、溴化乙锭（EB）（北京奇松生物科技有限公司）；乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA-Na2，纯度＞99.0%）、无水乙醇（纯度为99.7%）（北京索莱宝科技有限公司）。

2 方法

2.1 研究对象

75例肾移植术后患者均为沈阳军区总医院门诊随访患者（中国朝鲜族），患者接受肾移植手术时间范围为2001－2011年，全部为首次肾移植术。其中，男性42例，女性33例；年龄18～65岁，平均年龄（42.5±10.6）岁；体质量41～106 kg，平均体质量（67±9.8）kg。所有入组的患者均同时口服麦考酚酸吗乙酯和CsA抗排斥治疗，未出现严重感染或排斥反应，手术时间＞0.5年。入选的患者在2周内没有服用过可能对CsA体内代谢有影响的药物，如促胃动力药、H1受体拮抗药、钙离子拮抗药、抗结核类药、抗癫痫药、大环内酯类及四环素类抗生素等。

2.2 基因分型

提取人类基因组DNA:抽取200 μl静脉血液，按照试剂盒说明提取DNA。MDR1 C3435 T基因序列的扩增:向反应体系中加入10×Buffer 5 μl、dNTP 5 μl，根据文献合成的引物[4]，即:10Pmol/μl上游与下游引物各2μl（上游引物:5′-TGCTGGTCCTGAAGTTGATCTGTGAAC-3′；下游引物:5′-ACATTA GGCAGTGACTCGATGAAGGCA-3′）、DNA 样品 2.5μl、Taq酶0.2 μl、双蒸水18.3 μl，总体积30 μl。PCR反应条件为:94℃预变性3 min，然后94℃变性30 s，60℃复性30 s，72℃延伸1 min，共35个循环，最后72℃再延伸5 min。扩增的产物长度为248 bp，经限制性内切酶MboI 37℃酶切4 h，65℃水浴灭活20 min。以2.0%琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色，紫外成像系统观察结果。

2.3 数据分析

3 结果

MDR1 C3435 T基因片段PCR扩增后的产物为248 bp，电泳显示结果如图1。MDR1 C3435 T基因片段PCR扩增后的酶切产物如图2[1、2、6、7为野生型等位基因（C/C型），产生172、60、16 bp 3个片段；3、4、5、8为杂合型（C/T型），产生238、172、60、16 bp 4个片段；9为突变型等位基因（T/T型），产生248、16 bp 2个片段；由于16 bp片段太短，已泳出凝胶板，故未能在图中观察到]。M为DNA标准品（Marker）。75例患者的基因分布频率为C/C 31例（41.3%）、C/T 37例（49.3%）、T/T 7例（9.3%），等位基因频率分别为C66%、T34%，具体见表1。患者的MDR1C3435 T各基因型频率经Hardy-Weinberg遗传平衡检验，结果均符合遗传平衡定律，说明研究对象符合群体代表性。

图1 MDR1C3435T基因多态性经PCR后电泳图M.Marker；1～7.PCR产物Fig 1 Electrophoretogram of MDR1 C3435T gene polymorphism by PCRM.Marker；1-7.PCR products

图2 MDR1C3435T基因多态性经PCR-RFLP电泳图M.Marker；1～9.PCR-RFLP产物Fig 2 Electrophoretogram of MDR1 C3435T gene polymorphism by PCR-RFLPM.Marker；1-9.PCR-RFLP products

在对表1分析中发现，P值均＞0.05，因此认为中国朝鲜族肾移植术后患者的MDR1C3435 T基因多态性对服药剂量、CsA谷浓度及调整剂量浓度没有显著性影响。

4 讨论

C3435 T基因多态性是最早进行研究的，也是目前为止认为最有可能影响MDR1编码的P-gp功能表达，进而影响药物在体内的代谢。国外有学者认为，口服CsA吸收不完全、个体间吸收的差异大，主要与MDR1多态性有关[5-6]。由于免疫抑制剂CsA治疗窗范围较窄而药动学参数的个体间差异较大，因此对器官移植患者服用CsA血药浓度的监测是有必要的。CsA的血药浓度变化除了与个体的生理、病理因素有关外，还与遗传（种族、性别、基因多态性）和环境（食物或联合用药）等因素有关[7]。有研究表明，80%的口服CsA血药浓度的差异与肝脏细胞色素P4503 A（CYP3 A）和小肠P-gp的活性差异有关[3]。现已证明C3435 T的SNP与P-gp的表达最为密切，Hoffmeyer S等[8]首先报道具有T/T型的健康白种人群中，P-gp的表达比其他基因型降低了2倍。国外对MDR1基因型和表型的关系进行了很多研究，但结论并不一致。法国学者采用大样本肾移植病例研究显示[9]，C1236 T对服用不同剂量CsA患者的ρmax、AUC0-4h有影响，统计学呈显著性差异；而CYP3 A5*3、C3435 T、G2677 T/A和MDR1-129 T＞C则对不同剂量CsA的谷浓度、AUC0-12h、ρmax和AUC0-4h无显著影响。亚洲人心脏移植病例的研究提示[10]，MDR1G2677 T/A、C3435 T、C1236 T对CsA谷浓度、AUC0-12h、AUC0-4h和ρmax无明显影响；而CsA的剂量与基因类型的相关性却存在于单倍体型TT-TT-TT、CC-GG-CC和CT-GT-CT之间，即CsA谷浓度、AUC0-12h、AUC0-4h和ρmax按照野生型纯合子、杂合子、突变型纯合子顺序，依次增高[11]。因此，服用不同剂量CsA的谷浓度是否会受到MDR1、CYP3 A5和CYP3 A4等基因多态性的影响，意见还不统一，这可能与人种差异、性别、药物剂量、剂型、疾病状况等综合因素影响有关。

表1 MDR1C3435T不同基因型患者各项参数比较（）Tab 1 Comparison of parameters in different C3435T gene types（）

表1 MDR1C3435T不同基因型患者各项参数比较（）Tab 1 Comparison of parameters in different C3435T gene types（）

与C/C基因型比较:＊P＞0.05vs.C/C gene type:＊P＞0.05

基因型C/C C/T T/T例数（占比，%）31（41.3）37（49.3）7（9.3）口服剂量，mg/（k g·d）3.62±1.893.73±1.22＊3.46±1.48＊Cs A谷浓度，n g/ml 173.85±79.53161.91±66.21＊190.45±73.89＊调整剂量浓度，n g/ml p e r mg/k g 51.60±23.4845.06±19.27＊59.35±25.46＊等位基因频率C，%66 T，%34

C3435 T基因型的分布频率在不同的人种中存在差异，Wang Y等[12]研究112例中国汉族人群C3435 T位点C/C、C/T和T/T型的分布频率分别为37.5%、48.2%和14.3%，C等位基因频率为61.6%，T等位基因频率为38.4%。这与本研究结果相近，说明中国朝鲜族人群与中国汉族人群C3435 T基因多态性没有很大差别。Ameyaw MM等[4]研究发现非洲人群C等位基因频率明显增高，这可能与非洲人群处于胃肠道疾病易感地区有关，是自然选择的优势。

本文首次以中国朝鲜族肾移植术后患者为研究对象，考察了此人群MDR1中26外显子C3435 T多态性与CsA谷浓度的关系。试验结果提示，在现有采集样本下，未发现MDR1 C3435 T基因多态性对CsA谷浓度有显著性影响。这一结果与Wang Y等[12]就MDR1 C3435 T多态性对CsA剂量调整的谷浓度影响的研究结论相似，可以认为MDR1 C3435 T基因多态性可能不是影响CsA谷浓度的主要因素。

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