不同发育期诸氏鲻虾虎鱼对钻井液的敏感性比较

李建军，吴美慧，叶惠欣，黄 韧

(广东省实验动物监测所，广东省实验动物重点实验室，广州 510663)

我国现行的鱼类毒性试验标准中，大多仅规定了 试验鱼体长或体重范围，而未对其发育期提出要求［1－4］。硬骨鱼类胚后发育可分为仔鱼、稚鱼、幼鱼、成鱼4个主要时期，受环境、营养等因素的影响，相同体长或体重鱼类可能处于不同的生长期，而不同生长期鱼类对毒物的敏感性存在较大差异，如褐牙鲆仔鱼阶段对胜利原油的敏感性远远大于稚鱼阶段［5］。

诸氏鲻虾虎鱼(Mugilogobius chulae)属于鲈形目，虾虎鱼科，鲻虾虎鱼属，为暖水性底层小型鱼类，分布于香港、日本、菲律宾、泰国及西太平洋海域，栖息于河口、咸淡水水域中，体长(30～40)mm［6］，具有分布广、个体小、性成熟早、生殖力强、产卵间隔期短等特点。目前笔者已完成该鱼的全人工繁育技术研发，初步应用试验结果表明，该鱼对污染物敏感、实验操作方便、结果重复性强，是毒性试验中优良的受试生物。

钻井液指在钻井过程中使用的具有润滑和冷却钻头、携带钻屑、平衡地层压力等作用的循环流体，包括水基钻井液、油基钻井液和合成基钻井液。钻井液是提高钻井效率的重要手段，在石油与天然气的开采、钻探以及修井过程中，都会产生大量的钻井液，其主要污染物包括 (1)石油类，为改善钻井液的润滑性能而人为添加的油基润滑剂和钻进油层时进入到钻井液中的原油;(2)重金属，如Hg、Cd、Ti、Pb、Cr、In、Sn 等;(3)有机物，如丙烯酞胺、丙烯晴等;(4)钻井液添加剂，如造浆材料、加重材料、降滤失剂、增粘剂、乳化剂、页岩抑制剂、降粘剂、絮凝剂、润滑剂、杀菌剂、消泡剂、解卡剂、缓蚀剂、堵漏剂及泡沫流体、饱和盐水钻并液等;(5)无机盐类。目前，国内外对废钻井液的环境影响和毒性评价工作都非常重视，只有通过对各种体系、类型的钻井液对动植物生长、发育、残毒和毒性等一系列指标的测试研究，才能确切地了解其对生态环境影响的程度［7］。

本文以诸氏鲻虾虎鱼为实验鱼类、以钻井液为参比毒性物质，比较了其早期仔鱼、中期仔鱼、晚期仔鱼、稚鱼、幼鱼及成鱼对毒性物质的敏感性，为筛选试验鱼适宜急性毒性试验的发育期，进一步修订相关毒性试验标准积累基础数据。

1 材料和方法

1.1 受试物

水基钻井液:中海石油(中国)有限公司某分公司钻井部提供，棕褐色液体，阴凉处保存，参照文献［8］方法，配制为 31.25、62.5、125、250、500 mg/L五个浓度梯度。

1.2 试验条件

早期仔鱼(2日龄)、中期仔鱼(10日龄)、晚期仔鱼(20日龄)、试验容器为250 mL玻璃烧杯，试验溶液为100 mL，稚鱼(30日龄)、幼鱼(54～56日龄)、成鱼(150日龄)试验容器分别为500 mL、1 000 mL、2 000 mL玻璃烧杯，试验溶液分别为 400、800、1 500 mL;卤虫试验容器为100 mL玻璃烧杯，试验溶液为50 mL;每试验容器放生物10个，各试验组设2个重复;试验用海水经沙滤和紫外灭菌处理，pH 值 8.1 ～8.3，盐度 29，溶氧 5.0 ～7.2 mg/L。试验期间水温为(24～26)℃，自然光照。试验期间早期仔鱼不投饵，中、晚期仔鱼毎尾每24 h投喂约500个轮虫，稚、幼、成鱼毎尾每24 h投喂约10～20个卤虫无节幼体，毎个卤虫每24 h投喂盐藻适量。

1.3 结果判定与统计

仔、稚、幼鱼以轻触无反应或在体视显微镜下观测心脏停止跳动判定为死亡;卤虫沉到容器底部15 s内不能游动者判定为死亡。

半致死浓度(LC50)及95%置信区间的计算采用概率单位法或 Spearman－Karber计算法［8］

2 结果

2.1 钻井液对不同发育期诸氏鲻虾虎鱼的急性毒性

钻井液对不同发育期诸氏鲻虾虎鱼的急性毒性试验结果见表1。早期仔鱼48 h半致死浓度为157 mg/L，95%置信限为130～189 mg/L;中期仔鱼在钻井液浓度为125、250、500 mg/L的试验组中48 h死亡率分别为40、45和35%，由于对照组有2尾鱼死亡，采用公式)(其中表示校正后第i组的死亡率;第i组的死亡率;表示对照组的死亡率)进行校正，则中期仔鱼在钻井液浓度为125、250、500 mg/L的试验组中48 h校正后死亡率分别为 33.3、38.9 和 27.8%，均未超过50%，表明中期仔鱼48 h半致死浓度超过500 mg/L;中期仔鱼96 h半致死浓度为79 mg/L，95%置信限为50～124 mg/L;晚期仔鱼96 h半致死浓度为625 mg/L，95%置信限为396～985 mg/L;96 h稚鱼、幼鱼和成鱼死亡率低，其半致死浓度显著大于500 mg/L。不同反应期诸氏鲻虾虎鱼对钻井液的敏感性顺序为:早期仔鱼﹥中期仔鱼﹥晚期仔鱼﹥稚、幼、成鱼。

表1 暴露于不同浓度钻井液后各发育期诸氏鲻虾虎鱼的存活数Tab.1 The number of M.chulae at different developmental stages surviving in the drilling fluid at different concentrations

表2 暴露于不同浓度钻井液96h后卤虫无节幼体的存活数Tab.2 The number of Artemia nauplius surviving after 96 hours in the drilling fluid at different concentrations

2.2 钻井液对卤虫无节幼体的96h急性毒性

本钻井液对卤虫无节幼体的急性毒性结果见表2，卤虫无节幼体96 h半致死浓度为105 mg/L，95%置信限为62～177 mg/L。

3 讨论

3.1 诸氏鲻虾虎鱼在海洋污染物生物毒性评价方面具有良好的应用前景

鱼类作为水域生态系统中较高级的消费者，环境理化因子的变化通过上行效应改变鱼类群落结构和数量，而鱼类群落结构的变化通过营养级联和下行效应对水体的理化特征以及其它生物的组成、分布、丰度、生物量等水生态系统结构与功能的许多方面产生影响，在水生态系统中占有重要地位;当水体受污染后，鱼类能通过呼吸、皮肤吸收、体表吸附尤其是摄食等多种途径摄取水环境中的污染物，对污染物的富集能力较强;作为低等脊椎动物的代表，鱼类终生生活于水中，且有材料易得、繁殖力强、大部分体外受精、体外发育等特点，因此，相对于其它水生生物，鱼类毒性试验的应用更为普遍。

卤虫无节幼体也是一种常用的海洋污染物生物毒性评价的实验生物，美国国家环保局(EPA)把它列为排污的毒性试验生物［9］，国内也有应用卤虫监测农药、废水等毒性的报道［10，11］。本研究中，诸氏鲻虾虎鱼早期、中期仔鱼对钻井液的敏感性强于卤虫无节幼体。此外，卤虫无节幼体因虫卵来源、保存、孵化条件等不同，活力和对毒物的敏感性会出现一定程度差异;卤虫幼体和蒙古裸腹溞因附肢刚毛易粘附油性成份、干扰正常生理状况而不适用于油基钻井液等油性物质的毒性评价;对虾、贝类幼体等也因季节性因素不便于随时开展试验;相对于 GB/T 18420.2－2009《海洋石油勘探开发污染物生物毒性 第二部分 检验方法》推荐的裸项栉虾虎鱼［8，12］，诸氏鲻虾虎鱼具有个体较小、性格温顺、广温、广盐、饲养管理简便、繁殖期长，生殖力更强等优势，因此，敏感性适中、室内全年可人工繁育、易于推广应用的诸氏鲻虾虎鱼更适用于海洋污染物的毒性评价。

3.2 诸氏鲻虾虎鱼早期仔鱼具有显著的海洋污染物急性毒性评价优势

本研究结果表明，相对于其它发育阶段，诸氏鲻虾虎鱼早期仔鱼对钻井液的毒性最敏感。鱼类早期阶段是整个生命周期中最脆弱的时期，早期发育是一个在形态、生理、行为等方面不断变化的过程，对外界不良条件的刺激表现最为敏感［13，14］，随着鱼龄的增加，鱼类对毒物的耐受度提高［15］;Mckim(1977)研究了不同学者用34种毒物和4种鱼进行56次生活周期毒性试验资料后也认为，胚胎－仔鱼和早期幼鱼生活阶段在生活周期实验中是最敏感的阶段之一，生活环境的细微变化，就可引起胚胎和仔鱼生理上的剧烈反应，由胚胎、仔鱼或早期幼鱼试验估计的最大允许毒物浓度与通过更多发育阶段或全生活周期的毒性试验所获得的结果一致［16］。

诸氏鲻虾虎鱼初孵仔鱼至孵出后4日龄为早期仔鱼时期，处于内源性营养期，其生长发育主要消耗内源性卵黄营养，此时期不需投喂饵料，成活率较高，而进入外源性营养期后，除对毒物的敏感性降低外，部分鱼由于无法获取足量适口食物，死亡率升高;早期仔鱼阶段个体小，相比于稚、幼和成鱼，在试液体积、操作方便性及生产管理成本上优势明显。因此，诸氏鲻虾虎鱼的早期仔鱼更适于海洋污染物的急性毒性评价。

3.3 诸氏鲻虾虎鱼早期仔鱼急性毒性试验的时点选择

水温(24～25)℃，诸氏鲻虾虎鱼孵出后1～2日龄开始摄食，如不及时投喂饵料，4日龄卵黄囊内卵黄消耗完全，此后仔鱼虽可继续存活一段时间(约24 h～48 h)，但已丧失摄食能力。为避免仔鱼饥饿死亡导致的试验误差，建议急性毒性试验于仔鱼孵出后12 h～24 h时开始，经24 h或48 h结束。

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［3］于相毅，毛岩，卢玲，等.GB/T 21800－2008 化学品 生物富集流水式鱼类试验［S］.

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