Muc2和DCN基因敲除小鼠食子现象的初步研究

李 巍，贺国洋

(1.新乡医学院第二附属医院河南省生物精神病学重点实验室，河南 新乡 453002;2.新乡医学院病理学教研室，河南 新乡 453003)

Muc2基因是1989年由美国学者 Gum 等［1］自人小肠cDNA表达文库中克隆到的一种粘蛋白核心肽基因，后在气管支气管黏膜表面又克隆到该基因。定位在11p15.3～15.5上，此基因编译一种分泌性粘蛋白。粘蛋白Muc2是高分子量的富含糖链的糖蛋白，是上皮细胞产生的粘液中主要成分，广泛分布于消化道黏膜，起保护和润滑作用。

核心蛋白聚糖(DCN)是存在于细胞周围基质组织中的一种富含亮氨酸的低分子蛋白多糖，以核心蛋白(44 kDa)和蛋白聚糖(72 kDa～130 kDa，smear)两种形式表达于组织细胞中［2］。DCN参与抑制胶原纤维形成、调控细胞的增殖和粘附等过程［3］，可能是肿瘤的发生发展及转移的重要抑制因子。因此我们从美国芝加哥大学生物学实验室(University of Illinois at Chicago Biological Laboratory)成功引入了Muc2和DCN基因敲除纯合子，通过在SPF级(无特定病原体动物)动物房中饲养、繁殖，为研究 Muc2和 DCN基因在肿瘤的发生发展及转移中的功能提供了实验动物模型。以期了解Muc2和DCN基因对动物生长发育方面的影响，为该基因敲除品系小鼠的研究应用提供背景资料。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物:小鼠从美国(University of Illinois at Chicago Biological Laboratory，USA)购买，雄7只，雌9只，品系为C57BL/6J;基因背景为Muc2基因敲除纯合子(Muc2－/－)和 DCN基因敲除纯合子(DCN－/－)，在我实验室 SPF级动物实验室自行繁殖(SYXK(豫)2009—0002)。

1.1.2 仪器:BCN-1300 II A/B生物洁净安全柜，苏州净化设备有限公司生产;实验动物自动饮水机，上海摩勒科学仪器有限公司;独立送风隔离笼具IVC-Ⅱ型，苏州冯氏实验动物设备有限公司。

1.1.3 饲养管理:选择8周龄的Muc2和DCN基因敲除 C57BL/6小鼠，按雌雄1∶1或1∶2方式交配，长期合笼饲养于SPF级屏障环境内，雌鼠怀孕后期单独饲养，子代离乳后单独饲养，用于实验研究。离乳后的亲代雌鼠继续按雌雄1∶1或1∶2方式长期合笼饲养于SPF级屏障环境内。室内温度设定于(20～26)℃;相对湿度30% ～70%;昼夜明暗交替时间为12/12 h。饲料予以河南省实验动物中心小鼠大鼠生长、繁殖颗粒饲料，饮水由实验动物饮水机提供，动物自由进食和饮水。垫料为购自河南省实验动物中心垫料，垫料经高温灭菌，烘干后使用，垫料每周更换2次。饲养用笼具及饮水器每次更换清洗后均使用84消毒液浸泡和75%酒精消毒，动物房每次换完垫料用84消毒液对地板消毒，且每次更换笼具前动物房预先用紫外线照射30 min消毒。

1.2 方法

1.2.1 繁殖性能的观察:分别统计 Muc2和 DCN基因敲除小鼠1～3胎平均产仔数、胎次间隔时间和出生后子代存活率。

1.2.2 出生后亲代食子代现象的观察:分别从Muc2和 DCN基因小鼠1～4胎初生仔鼠中选择30窝进行食子现象观察。

1.3 统计学方法

统计学处理所有的数据采用SPSS 13.0软件进行分析，正态分布的计量资料以±s表示，组间均数采用两独立样本t检验，计数资料组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠的繁殖性能

Muc2纯合子6只母鼠成功繁殖出100只子鼠，每胎平均产2～7只幼鼠，每只母鼠胎次间隔时间38～45 d。DCN纯合子3只母鼠成功繁殖出33只子鼠，每胎平均产3～5只幼鼠，每只母鼠胎次间隔时间为16～45 d。Muc2和DCN基因敲除的小鼠比较平均产子量和胎次间隔时间均存在明显差异。结果如表1。

表1 两组基因敲除小鼠繁殖性能比较(±s)Tab.1 Comparison of the reproductive performance of gene knockout mice of the two groups(±s)

表1 两组基因敲除小鼠繁殖性能比较(±s)Tab.1 Comparison of the reproductive performance of gene knockout mice of the two groups(±s)

平均产仔数(只)Average litter sdize 5.80±0.95 3.85±0.76 10.694 0.00胎次间隔时间(d)Birth interval time 42.29±2.28 24.86±10.42 25.902 0.00

2.2 小鼠食子现象情况

Muc2与DCN基因敲除小鼠在出生后1～3 d存在食子现象(一窝子鼠一旦出现亲代食子代现象，最终会把所有子代吃光)，选取18窝Muc2基因敲除小鼠和12窝DCN基因敲除小鼠比较，其中18窝Muc2基因敲除子鼠2窝出现食子现象，共12只子鼠被母鼠吃掉。12窝DCN基因敲除小鼠6窝出现食子现象，15只子鼠被母鼠吃掉。比较Muc2与DCN基因敲除小鼠食子现象和出生后存活率均存在明显差异。如表2。

表2 两组基因敲除小鼠食子现象比较Tab.2 Comparison of the differences of kronismus in the two groups of gene knockout mice

3 讨论

基因敲除是基因打靶技术的一种，类似于基因的同源重组。指外源DNA与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，从而代替受体细胞基因组中的相同/相似的基因序列，整合入受体细胞的基因组中。基因敲除小鼠由于外源基因的导入而改变了自身基因组，从而改变一些基因的表达和遗传形状。Muc2和DCN是肿瘤相关基因，参与肿瘤的形成。为了研究Muc2和DCN基因在肿瘤的发生发展及转移中的作用，我们从美国引进了一批Muc2和DCN基因敲除的小鼠，来研究与肿瘤的关系。在饲养观察中发现，Muc2基因敲除鼠仔平均产仔量、胎次间隔时间和产后子代存活率均高于DCN基因敲除的小鼠，两组小鼠存在明显差异。

Muc2和DCN基因敲除的小鼠来自于C57BL/6J，遗传背景一样，由于各自外源DNA的和自身基因的同源重组，发现他们在繁殖性能方面有差异，提示Muc2和DCN基因不仅是癌症的相关基因，可能也影响小鼠的繁殖能力，然而Muc2和DCN基因是通过何种机制影响繁殖能力尚需要进一步研究。

在饲养基因敲除小鼠的过程中，我们观察发现母鼠吃子代的现象(食子现象)，食子现在在基因敲除小鼠饲养过程中经常出现［4］，很多研究认为是外界环境因素的影响，比如受到惊吓、缺水、食物营养供应不足、饲养环境差等因素。在我们的饲养过程中，我们购进的是复合颗粒饲料，定期喂生葵花籽，保证营养供应全面。尽可能减少观察次数，饲养人员每次都带口罩和手套，添加饲料和水前先喷洒医用酒精遮盖外来气味，避免人为因素引起食子现象。在这样的前提下，我们发现Muc2和DCN基因敲除小鼠在食子现象中存在明显差异，可能外源DNA的同源重组，影响了繁殖先关的基因，从而引起母鼠遗传性状的改变，或者Muc2和DCN基因可能影响母鼠对子鼠的识别能力。由于我们的样本量小，统计的周期短，可能对结果也有一定的影响。

总之，除了外在环境条件(惊吓、外带异味、缺乏营养等)的影响，基因敲除小鼠存在食子现象，Muc2和DCN基因敲除小鼠都是来源于品系为C57BL/6J的小鼠，遗传性状相同，我们发现在繁殖性能和食子现象中存在明显的差异，具体原因尚未明确，有待于进一步研究。

4 结论

Muc2和DCN基因不仅是癌症相关基因，同源重组的Muc2和DCN基因也可能影响小鼠的繁殖性能及对子代的识别能力。

［1］Gum JR，Byrd JR，Hicks JW，et al.Molecular cloning of human intestinal mucins cDNAs［J］.J Biol Chem，1989，26(1 －1):6480.

［2］Goldoni S，Owens RT，McQuillan DJ，et al.Biologically active decorin is a monomer in solution［J］.J Biol Chem，2004，279(8):6606－6612.

［3］Augoff K，Rabczynski J，Tabola R，et al.Immunohistochemical study of decorin expression in polyps and carcinomas of the colon［J］.Med Sci Monit，2008，14(10):CR530 － CR535.

［4］乔录新，徐萌，柴梦音，等.p53基因敲除小鼠的饲养繁殖及鉴定［J］.实验动物科学，2012，2:100－102.