原料乳中产耐热蛋白酶细菌的鉴定及其酶学特性研究

张 熙， 母智深

（1.华南理工大学 生物科学与工程学院，广东 广州510006；2.内蒙古农业大学 食品科学与工程学院，内蒙古呼和浩特010018）

荧光假单胞菌是低温冷藏原料乳中常见的一类细菌[1]，其种类繁多，广泛存在于低温环境中。已经了解的嗜冷菌中，细菌就有30多个属，其中属于革兰氏阴性的Pseudomoas属和革兰氏阳性Bacillus属的较多[2]。而原料乳中以兼性嗜冷菌为主，从原料乳中分离到的嗜冷菌以假单胞菌属（Pseudomonas），特别是荧光假单胞菌（P.fluorescens）居多。产生热稳定性蛋白酶和脂肪酶的主要是假单胞菌属[3]，这类菌增长速度快，在2℃条件下仍能生长良好[4]。该类细菌其本身不耐热，一般巴氏杀菌条件可以将其杀死，但它们分泌的胞外耐热性蛋白酶可以耐受UHT杀菌条件（140℃，4 s）。该类蛋白酶经常引起UHT乳及其它乳制品在货架期内发生水解、凝块、变苦等品质劣变现象[5]。

研究中从原料乳中分离得到一株产耐热蛋白酶的嗜冷细菌，采用多项鉴定方法对其进行了鉴定。在此基础上研究耐热蛋白酶的部分酶学特性和耐热性。为在乳品工业中如何控制以及耐高温蛋白酶将来利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 产耐高温蛋白酶菌株分离与筛选

1.1.1 嗜冷菌分离 原料乳取自内蒙古呼和浩特市周边奶站。原料乳用划线法直接涂布于固体培养基[6-7]（胰蛋白胨 5 g/L，酵母浸膏 2.5 g/L，葡萄糖 1 g/L，琼脂 20 g/L，pH 7.2），6.5℃条件下恒温培养7 d。挑取单个菌落，观察菌落大小、形状、色泽、色素产生、表面光滑程度、边缘整齐度。选取形态差异的菌落，结合革兰氏染色进行嗜冷菌筛选。平板上划线纯化2~3次后得到纯培养物。

1.1.2 嗜冷菌筛选 将分离纯化的嗜冷菌菌株分别接种于1.0 g/dL的酪蛋白琼脂培养基上置于20℃培养5 d。选择水解圈大而明显的菌株，进一步纯化并保存。将产生水解圈的菌株，接入50 mL上述液体培养基中，20℃，培养48 h，然后取5 mL接种到100 mL相同液体培养基中，于20℃条件下，摇床（120 r/min）培养5 d。将发酵液在15 000 g条件下低温（4℃）离心20 min，上清液即为胞外蛋白酶粗酶液。分别测定上清液酶活和经过95℃，5 min加热后酶的剩余活力。根据上述两项指标选择一株目标菌株。

1.2 形态学和生理生化鉴定

将入选菌株划线于上述固体培养基，在20℃下培养2 d，观察其菌落形态；并在电子显微镜下观察菌株的细胞形态。形态观察、生理生化试验参照《伯杰氏细菌鉴定手册（第九版）》[8]和《工业微生物实验技术手册》[9]。

全细胞脂肪酸分析采用GC-MS[10]。2 000 mL的锥形瓶盛1 000 mL灭菌NB培养液。按体积分数5%接种，20℃摇床（120 r/min）培养36 h。培养菌液于5 000 g离心15 min。弃去上清液。沉淀菌体用超纯水洗涤3次。取出菌体约400 mg（湿重）细胞移入有Teflon盖的试管中。向样品管中加入体积分数15%NaOH－甲醇10 mL，100℃水浴30 min，然后加入体积分数25%HCL-甲醇20 mL，水浴80 ℃，10 min，冷却后分别加入10 mL的水和乙醚提取细胞脂肪酸甲酯（FAMEs），将乙醚提取物用氮气流吹干，加入100 μL正己烷溶解。取2 μL正己烷作GC-MS分析。

1.3 16S及16S-23S rDNA间区的PCR扩增及分析

细菌基因组DNA的提取见参考文献[11]。引物采用革兰氏阴性细菌通用引物，由大连宝生物公司提供，引物序列见表1、表2。

表1 16S rDNA PCR扩增引物Table 1 16S rDNA sequencing primers used in PCR

表2 16-23S rRNA扩增引物Table 2 16S-23S rRNA sequencing primers used in PCR

PCR反应见文献[12-14]。将测序结果在NCBI中进行Blast后交送GeneBank数据库，与数据库中已有序列对比，进行系统发育分析。

1.4 蛋白酶催化温度和pH确定及耐热性研究

1.4.1 蛋白酶最适作用温度 将蛋白酶与底物溶液（偶氮酪蛋白）混合，分别置于 20，25，35，40，45℃和50℃下反应2 h，测定蛋白酶活力。

1.4.2 蛋白酶最适作用pH确定 配置pH值范围在4.6到10.6的多种缓冲溶液，pH值间隔为0.5。其中乙酸-乙酸钠缓冲液 pH 4.6～5.8，磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液 pH 6.0～7.0，Tris-HCl缓冲液 pH 7.2～8.8，甘氨酸-氢氧化钠缓冲液 pH 9.0～10.6。 用上述缓冲液分别代替Tris-HCl（pH 7.5）缓冲溶液，测定蛋白酶活力。

1.4.3 酶热稳定性测定 取60 μL酶液，置于4 mm×40 mm密封玻璃管中，用油浴加热。热电偶置于另一玻璃管中，测定酶液加热到指定温度所需的时间。 加热温度分别为 80，90，100，110，120，130 和140℃，酶受热时间4 s。酶液加热结束后，将玻璃管置于20℃水中快速冷却。取热处理后酶液40 μL，测定蛋白酶剩余活力。

1.5 酶活力测定方法

以偶氮酪蛋白（azocasein）为底物，测定蛋白酶水解活性[15]。先将酶溶液，底物，缓冲液在40℃水浴中预热，然后将 1 250 μL 酶溶液（pH 7.5，20 mmol/L Tris-HCl缓冲液稀释）添加到1 750 μL偶氮酪蛋白溶液中（1.5 g/dL），40℃水浴2 h后，加入 3 000 μL 10 g/dL三氯醋酸中止反应。混合物立即在4℃下离心（10 000 g，10 min），取 2 400 μL 上清液，用600 μL 1.8 mol/L NaOH溶液中和，在420 nm处测定其吸光度值。1个酶活力单位（unit）定义为：在上述实验条件下，2 h内，每毫升酶液，每增加0.01个OD420nm定义为1个酶活力单位。酶活力计算公式为：酶活（U/mL）=OD420nm×100×K/V。 其中 U 为酶活力单位，OD420nm为420 nm下酶的吸光度值，K为酶的稀释倍数，V为酶液量。

1.6 数据统计

采用软件SSPS12.5进行数据分析，所有数据来自最少3个独立实验，并各重复3次。

2 结果

2.1 形态学鉴定

在培养基上，被选菌株菌落呈现淡白色圆形，表面光滑，边缘整齐。从透射电镜的照片（图1，图2）可以看出，该菌株为杆菌，大小为0.6 μm×2.0 μm，无菌柄也无鞘，不产芽孢，有鞭毛，且鞭毛数大于1。依菌株的菌落形态和细胞形态，可以初步判定该菌归属于荧光假单胞菌，并编号Rm12。

2.2 生理生化鉴定

生理生化特征鉴定见表3。该菌为革兰氏阴性细菌，产荧光色素，不产非荧光色素，产果聚糖，反硝化实验阴性，卵磷脂酶，脂酶阳性，能在4℃下生长，41℃不生长。其大部分生理生化特性与荧光假单胞菌（P.fluorescens）最为接近。

菌株Rm12的细胞脂肪酸（CFAs）分析结果见表4。其中具有鉴别意义的脂肪酸分别是3-羟基癸酸（C10：0）、2-羟基月桂酸（C12：0）、3-羟基月桂酸（C12：0）、肉豆寇酸（C14：0）、棕榈油酸（C16：1）、反式棕榈油酸（C16：1）、棕榈酸（Cl6：0）、油酸（C18：1）、反油酸（C18：1）和 硬脂酸（C18：0）。Rm12不仅含有假单胞菌所共有的饱和脂肪酸 C16：0，及不饱和脂肪酸 C16：1及 C18：1，同时也含有被认定假单胞杆菌的特征脂肪酸的 C10：03OH和 C12：03OH。

图1 菌株Rm12的电镜扫描图片Fig.1 TEM micrograph of Rm12 cell

2.3 分子鉴定

2.3.1 16S鉴定结果

用革兰氏阴性细菌通用引物扩增菌株Rm12的16S rDNA基因，获得1 455 bp的片段，并测序。采用NCBI网站中的Blast工具，将菌株Rm12的16S rDNA基因序列与GenBank中查得的相关序列进行比较，得到与其序列同源性较高的相关菌株的16S rDNA序列，采用CLUSTALX 1.8软件对所测定的核苷酸序列进行排列，用系统发育推断软件包PHYLIP 3.5 c中的距离依靠法构建系统发育树。结果表明，Rm12菌株与假单胞菌属（Pseudomonas）一些种的序列同源性高。与AM410618，DQ279328，DQ279327的最大相似度高达100%。与AY747594，AM411619，DQ219372，DQ200857，DQ314540，DQ31 4541，DQ200851，DQ314546 的相似度高达 99%，除AY747594被鉴定为P.reactans，其它菌株均被鉴定为假单胞杆菌的变种。因此，从分子分类学的角度来看Rm12菌株属于假单胞菌属的菌种。

图2 菌株Rm12多个菌体电镜扫描图片Fig.2 TEM micrograph of Rm12 cells

表3 Rm12菌株的生理生化特征Table 3 Physiological and biochemical character of Rm12

图3 根据16S rDNA序列建立的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of Rm12 based on 16s rDNA

2.3.2 16-23S rRNA间区鉴定结果 通过对Rm12菌株的16S-23S rRNA间区序列测定，获得1056 bp基因片段。将菌株Rm12的16S-23S rRNA间区序列与GenBank中查得的相关序列进行比较。结果是，Rm12菌株与假单胞菌属（Pseudomonas）中的荧光假单胞杆菌（P.fluorescens）的一些菌株的序列同源性较 高 。 该 菌 株 与 AF127587.1，AF127586.1，AF127585.1的最大相似度高达100%，与AY582369.1，AY582380.1，AY582371.1 的相似度也高达99%，与其它菌株的最大相似度均达到了95%以上。因此，从分子分类学的角度进一步确定Rm12菌株属于荧光假单胞杆菌。

图4 根据16-23S rRNA序列建立的系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of Rm12 based on 16～23S rRNA

2.4 蛋白酶的最适温度和最适pH

在不同温度下测定蛋白酶活力。结果（图5）表明，该酶的最适反应稳定为40℃，活力达到5 403 U/mL，酶的温度影响曲线并不对称，低于最适温度时，酶活力上升较为平缓，高于最适温度时，酶活力下降相对较快。

不同pH下蛋白酶活力测定结果（图6）表明，该酶的最适pH为7.5。在pH值低于7.5或高于7.5时，酶活力下降的速度较快。

图5 不同温度对蛋白酶的影响Fig.5 Effect of temperature on the protease

图6 不同pH对蛋白酶活力的影响Fig.6 Effect of pH value on protease

2.5 酶的热稳定性

原 酶液 在 80，90，100，110，120，130 和 140 ℃条件下加热4 s，测定剩余活力。见图7，从80℃到140℃，随着温度升高，酶的活力呈明显下降趋势。原酶液在140℃下加热4 s，剩余活力为321.55 U/mL。剩余活力为原酶液活力的6.66%。

图7 酶的热稳定性测定Fig.7 Effect of high temperature on the protease

3 讨论

根据形态鉴定，生理生化特性，菌体脂肪酸含量和种类测定，16S rDNA及16-23S rRNA区间基因序列分析，从原料乳中分离得到的菌株Rm12属于荧光假单胞菌（P.fluorescens）。

脂肪酸是微生物细胞组分中一种较为稳定的重要成分，它和细菌的遗传变异、毒力、耐药性等有极为密切的关系，它的种类和含量是细胞化分类法的重要依据之一。Gundlapalli[16]等人分离的嗜冷假单 胞 杆 菌 CMS35T，CMS38T 和 CMS64T 中 ，C16：0，C16：1， 和 C18：1均 为 它 们 的 主 要 脂 肪 酸 。 1987 年Ikemoto等人研究了50株不同假单胞杆菌，所有菌株中都存在直链的饱和脂肪酸C16：0，及不饱和脂肪酸 C16：1及 C18：1。Vancaneyt的实验进一步支持了这一观点。 C10：03OH和 C12：03OH被作为假单胞杆菌的特征脂肪酸[17]。

从实验结果可以看出，Rm12不仅含有假单胞菌所共有的饱和脂肪酸C16：0，及不饱和脂肪酸C16：1及C18：1，同时也含有被认定假单胞杆菌的特征物质的 C10：0 3OH 和 C12：0 3OH。

大多数耐热蛋白酶作用最佳温度多数在60～80℃之间，少数例外也在80℃以上[18-19]。而作者所分离得到的蛋白酶最适温度在40℃，与常规耐热蛋白酶的情况不一致，这可能与该蛋白酶的分子结构有一定的关系。pH值对酶反应的影响是多方面的，通过影响酶的构象和底物的荷电性质，从而影响酶的活性中心与底物的接近和结合程度。酶是一种两性化合物，在不同的pH下会以不同的解离状态存在，往往只有一种解离状态最适合酶促反应的进行，这就是最适pH值。此外，pH值还会影响酶的稳定性，极端pH值下能够导致酶的不可逆变性。

4 结语

通过以上分析，从原料乳中分离的菌株Rm12属于荧光假单胞杆菌（P.fluorescens），是一种产耐热蛋白酶的嗜冷菌。该菌所产的耐热蛋白酶可以耐受一般UHT灭菌条件 （140℃，4 s）。

[1]Haryani S，Datta N，Anthony J，et al.Production of proteases by psychrotrophic bacteria in raw milk stored at low temperature[J].Aust J Dairy Technol，2003，58（1）：15-50.

[2]李广武.低温生物学[M].长沙：湖南科学技术出版社，1998.

[3]Cusion M A.Presence and activity of psychrotrophic microoganismis in milk and dairy products：a review[J].Food Prot，1982，45：172-207.

[4]Griffiths M W，Phillips J D，West I G，et al.The effect of extended low temperature storage of raw milk on the quality of pasteurized and UHT milk[J].Food Microbiol，1988（5）：75-87.

[5]Fairbairn D J，Law B A.The elect of nitrogen and carbon sources on proteinase production by Pseudomonas fluorescens[J].Journal of Applied Bacteriology，1987，62：105-113.

[6]惠艺.原料乳中嗜冷菌的测定 [J].中国乳品业，1998（5）：35-39.HUI Yi.Determination of Psychrophilic bacteria in raw milk[J].China Dairy Industry，1998（5）：35-39.（in Chinese）

[7]王克新，房玉国，张丽宏.液体乳中嗜冷菌的测定[J].乳品工业，2001（5）：31-32.WANG Ke-xin，FANG Yu-guo，ZHANG Li-hong.Determination of numbers of psychrotrophic mi-croorganisms in milk[J].China Dairy Industry，2001（5）：31-32.（in Chinese）

[8]John G H，Noel R K，Peter H A，et al.Bergey’s manual of determinative bacteriology[M].Ninth Edition.[S.I.]：Lippincott Williams&Wilkins，2000.

[9]诸葛健，王正祥.工业微生物实验技术手册[M].北京：中国轻工业出版社，1994：145-178.

[10]卢焱，叶萍，王靖，等.铜绿假单胞菌全细胞脂肪酸气相色谱分析及应用[J].中华医院感染学杂志，1997，7（1）：7-10.LU Yan，YE Ping，WANG Jin，et al.Gas chromatographic whole-cell fatty acid analysis and its application for the identification of Ps.Aeruginosa[J].Chinese Journal of Nosocomiology，1997，7（1）：7-10.（in Chinese）

[11]颜子颖，王海林译.精编分子生物学实验指南[M].北京：科学出版社，1998.

[12]钱斯亮，蔡宇杰，廖祥儒，等.热稳定性过氧化氢酶高产菌的筛选、鉴定及酶学性质研究[J].西北农业学报，2008，17（2）：238-242.QIAN Si-liang，CAI Yu-jie，LIAO Xiang-ru，et al.Screening，identification and enzymatic properties of the thermal stability Catalase-Producing strain[J].Acta Agriculturae Boreali-Occidentalis Sinica，2008，17（2）：238-242.（in Chinese）

[13]李玲，陈林，杨文革，等.一株他克莫司产生菌的筛选及鉴定[J].食品与生物技术学报，2010，29（3）：416-420.LI Ling，CHEN Lin，YANG Wen-ge，et al.Isolation and Identification of a tacrolimus producing strain[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2010，29（3）：416-420.（in Chinese）

[14]于洁，孙志宏，张家超，等.16S rDNA-RFLP技术鉴定西藏地区乳制品中的乳杆菌［J].食品与生物技术学报，2009，28（6）：804-810.YU Jie，SUN Zhi-hong，ZHANG Jia-chao，et al.Identification of lactobacillus isolated from Home-Made fermented milk in tibet by 16S rDNA-RFLP[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2009，28（6）：804-810.（in Chinese）

[15]Secades P，Alvarez B，Guijarro J A.Purification and characterization of a psychrophilic，calcium-Induced，Growth-Phase-Dependent metalloprotease from the Fish pathogen Flavobacterium psychrophilum[J].Appl Environ Microbiol，2001，67：2436-2444.

[16]Gundlapalli S N，Reddy G I，Matsumoto P S，et al.Psychrophilic pseudomonads from antarctica：Pseudomonas antarctica sp.nov.，Pseudomonasmeridiana sp.nov.and Pseudomonas proteolyticasp.nov[J].Int J Syst Evol Micr，2004，54，713-719.

[17]Garrity G M.Bergey’s Manual of Systematic Bacteriplogy[M].Second Edition.[S.I.]：Springer Publisher，2005.

[18]Fujiwara N，Masui A，Lmanaka T，et al.Purification and properties of the highly thermostable alkaline protease from and alkaliphilic a thermophilic Bacillus sp.[J].J Biotechnol，1993，30（2）：245-246.

[19]Beadell J S，Clark D S.Probing stability-activity relationship in the thermophilic protease from Thermoplasma acidphilum by random mutagenesis[J].Extremephiles，2001，5（1）：3-10.