酵母蛋白酶A活性检测方法的比较

宋 群，刘春凤，李永仙，王金晶，李 崎，*

（1.江南大学教育部工业生物技术重点实验室，江苏无锡214122；2.江南大学酿酒科学与工程研究室，江苏无锡214122）

酵母蛋白酶A（EC3.4.23.6）是一种天冬氨酸族蛋白酶，由PEP4基因编码[1-3]。分泌到胞外的蛋白酶A可降解发酵液和成品啤酒中的泡沫活性蛋白，从而降低纯生啤酒的泡沫稳定性[4-7]。如何准确测定纯生啤酒中极微量的蛋白酶A一直是研究者所关注的问题。蛋白酶A的检测方法大致可分为两类：利用天然底物测定[8-11]和利用合成底物测定[12-14]。天然底物涉及酪蛋白、偶氮酪蛋白、变性血红蛋白、非折叠肌红蛋白、胰岛素A链及B链、核糖核酸酶等，一般使用紫外分光光度法（UV法）、福林酚法（Lowry法）或考马斯亮蓝法（Bradford法）检测。合成底物包括生色肽、荧光肽等，利用底物显色或释放出荧光素来反映蛋白酶A的活性。这些方法或多或少存在一些缺陷，利用天然底物检测灵敏度较低，利用合成底物可以提高检测的灵敏度，但是也存在操作繁琐，或者价格昂贵、底物不易获得等缺点。近年来新兴的共振光散射技术（Resonance light scattering technique，RLS）因其具有灵敏度高、简便、快速等优点而得到迅猛发展[15-17]。本研究组利用酪蛋白与三氯乙酸相互作用形成缔合微粒，在468nm波长处产生较强的共振散射峰，建立了一种测定蛋白酶A活性的新方法—RLS法。本文比较了不同蛋白酶A活性检测方法的线性范围、精密度、检测限以及实际样品的测定差异，结果发现，RLS法具有明显优势，更适用于啤酒发酵液和成品啤酒样品的检测。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

蛋白酶A荧光底物（MOCAc-Ala-Pro-Ala-Lys-Phe-Phe-Arg-Leu-Lys（Dnp）-NH2） 日 本Peptide Institute，INC；福林酚试剂、考马斯亮蓝染色剂、牛血清白蛋白 生工生物工程（上海）有限公司；干酪素、NaOH、HCl、Gly、K2HPO4、KH2PO4、Na2CO3、TCA、Na2HPO4、NaH2PO4、柠檬酸等 上海国药集团化学试剂公司。

荧光分光光度计（650-60） 日本HITACHI公司；单光束紫外/可见分光光度计（UV1102） 上海天美科学仪器有限公司；精密pH计（FE20） 梅特勒-托利多仪器有限公司；电热恒温水浴锅（HHS） 上海博迅实业有限公司；超声波破碎仪（KQ3200DB） 昆山市超声仪器有限公司；台式高速离心机（5804R） 德国Eppendorf公司。

表1 不同浓度酶液的配制Table 1 Preparation of enzyme solution with different concentrations

1.2 实验方法

1.2.1 试剂配制 酪蛋白溶液（0.1%）：0.25g酪蛋白用60mL 6mol/L HCl加热、超声溶解，加Gly-HCl缓冲液，使其终浓度为0.1mol/L，用饱和NaOH溶液调节pH到3，定容到250mL，中速滤纸过滤。配制2.5mol/L TCA、10%TCA、0.4mol/L Na2CO3、K2HPO4-柠檬酸缓冲液（pH5.3）、PBS缓冲液（pH7.4）、各浓度牛血清白蛋白溶液。

酵母自溶液样品：将50g酵母泥用250mL Na2HPO4-KH2PO4缓冲液（pH6.5）室温下自溶24h后，在冰浴中用石英砂研磨自溶液，过滤，离心，取上清液为粗酶液。

发酵液样品离心取上清液；啤酒样品过滤除气。

1.2.2 UV法测定蛋白酶A活性[8]酶促反应：在10mL小试管中加入1mL酶液，再加入0.1%酪蛋白溶液1mL，混匀，40℃反应20min，加入2mL 10%TCA，终止反应。空白为在酶液中先加2mL 10%的TCA后，再加入酪蛋白溶液。

用10mm比色皿分别测定反应体系和空白体系在275nm处的吸光值A275反应和A275空白，蛋白酶A活性用吸光值差表示：△A275=A275反应-A275空白。

1.2.3 Lowry法测定蛋白酶A活性[9-10]酶促反应：同1.2.2。将反应体系和空白体系离心，分别取上清液1mL，加0.4mol/L Na2CO3溶液5mL、福林酚试剂1mL，振荡均匀，置于40℃水浴中显色20min，取出，用10mm比色皿分别测定它们在680nm处的吸光值A680反应和A680空白，蛋白酶A活性用吸光值差表示：△A680=A680反应-A680空白。

1.2.4 Bradford法测定蛋白酶A活性[11]酶促反应：同1.2.2。将反应体系和空白体系离心，分别取上清液0.1mL，加考马斯亮蓝染色剂3mL，室温放置5min，用10mm比色皿分别测定它们在595nm处的吸光值A595反应和A595空白，蛋白酶A活性用吸光值差表示：△A595=A595反应-A595空白。

1.2.5 RLS法测定蛋白酶A活性 酶促反应：在10mL小试管中加入0.1mL酶液，再加入0.1%酪蛋白溶液1mL，混匀，40℃反应20min，加入2mL 2.5mol/L TCA，加蒸馏水将体系体积补齐到5mL，混匀，缔合20min。空白为在酶液中先加2mL 2.5mol/L的TCA中止反应20min后，再加入酪蛋白溶液。

设定荧光分光光度计的发射光和激发光波长均为468nm，狭缝均为2nm，分别测定反应体系和空白体系的共振散射光强度I468反应和I468空白，蛋白酶A活性用光强差表示：△I468=I468空白-I468反应。

1.2.6 荧光底物法测定蛋白酶A活性[12-14]酶促反应：在10mL小试管中加入1500μL K2HPO4-柠檬酸缓冲液、1368μL蒸馏水、120μL酶液、12μL荧光底物，30℃反应30min，80℃灭活5min，快速冷却至室温。空白实验用蒸馏水代替酶液。

设定荧光分光光度计的发射光波长为393nm，激发光波长为328nm，狭缝均为5nm，分别测定反应体系和空白体系的荧光强度I反应和I空白，蛋白酶A活性用光强差表示：△I=I空白-I反应。

1.2.7 标准曲线的测定 用pH为7.4的PBS缓冲溶液配制不同浓度的牛血清白蛋白溶液（UV法：200～2000μg/mL，Lowry法：200～2000μg/mL，Bradford法：100～800μg/mL，RLS法：1～500μg/mL），分别按照上述1.2.2～1.2.5方法测定蛋白浓度与吸光值或光强值的关系，以蛋白浓度为横坐标，以吸光值或光强值为纵坐标绘制标准曲线。

1.2.8 RLS法的有效性验证 按照表1配制不同浓度的蛋白酶A溶液。分别用1.2.5和1.2.6的方法测定表1中10种酶液的酶活，以RLS法得到的△I468值为横坐标，以荧光底物法得到的△I值为纵坐标作图，比较两种方法的相关性。

2 结果与讨论

2.1 线性范围的比较

图1为UV法、Lowry法、Bradford法和RLS法的标准曲线。从线性范围来看，UV法和Lowry法适用于较高蛋白酶A浓度样品的检测，线性范围均为200～2000μg/mL；Bradford法适用的检测浓度较UV法略低，线性范围为100～800μg/mL；RLS法较其他3种方法灵敏度最高，标准蛋白浓度在1～500μg/mL之间时，标准曲线的线性良好（R2=0.9974）。四种方法的决定系数（R2）均较高，都大于0.9900，说明线性关系的拟合效果很好，线性回归模型可信。

2.2 精密度的比较

为了考察4种方法的精密度，实验中分别用4种方法对同一种酵母自溶液样品进行10次平行测定，计算不同方法的相对标准偏差，结果如表2所示。

表2 各方法的相对标准偏差Table 2 Relative standard deviation of four methods

从表2可以看出，Bradford法相对标准偏差较高，为3.15%，精密度略差。其他3种方法的相对标准偏差都比较低，UV法为0.52%，Lowry法为1.47%，RLS法为1.95%，均小于2.00%，精密度符合测定要求。

图1 标准曲线Fig.1 Standard curves

2.3 检测限的比较

按照国际纯粹与应用化学联合会（IUPAC）的规定，置信水平为99.86%时，方法的检测限由式（1）算出：

式中，δ空白为10次测定值的标准偏差。

根据公式（1）分别计算出的四种方法的检测限，结果见表3。

从表3可以看出，RLS法的检测限最低，为0.662μg/mL，大大低于其他3种方法，其他3种方法的检测限均高于10μg/mL。在实际的啤酒生产中，存在于发酵液和成品啤酒中的蛋白酶A都是极微量的，这就要求蛋白酶A活性测定方法具有足够低的检测限，所以RLS法具有明显优势。

表3 各方法检测限Table 3 Detection limit of four methods

2.4 啤酒样品测定的比较

为了比较不同测定方法在实际啤酒发酵过程中蛋白酶A活性检测方面的差异，实验选取3种成品啤酒样品和6种啤酒发酵液样品为研究对象，分别采用上述4种方法对不同样品中的蛋白酶A活性进行测定，结果如表4所示。其中，1～3号样品为三种生产日期接近的市售纯生啤酒；4～6号样品为相同发酵条件下3种不同菌种分别发酵6d后的样品；7～9号样品为相同发酵条件下上述3种不同菌种分别发酵10d后的样品。

表4 不同发酵液和成品啤酒中的蛋白酶A活性Table 4 Proteinase A activity of different fermentation broth and final beer samples

由表4可以看出，9种样品中的蛋白酶A活性均在UV法、Lowry法和Bradford法的检测限以下，因此这3种方法无法测定出实际样品中的蛋白酶A活性；而RLS可以检测到所有样品中的蛋白酶A活性。由于啤酒装瓶前都经过稀释，因此成品啤酒中的蛋白酶A活性均低于发酵液样品中的活性；发酵末期比发酵中期的蛋白酶A活性显著增强，但增强幅度因菌种不同而异。从测定结果可以看出，RLS法对于啤酒酿造过程中的蛋白酶A活性跟踪检测方面具有较强的适用性。

2.5 RLS法的有效性验证

荧光底物法是目前公认的检测蛋白酶A活性最准确的方法，实验中使用荧光底物法对共振光散射法的有效性进行验证。按1.2.8所述，配制不同浓度的蛋白酶A酶液，分别用上述两种方法检测酶活，考察两种方法的相关性（见图2）。结果显示，两种方法的相关性高，决定系数R2为0.9917，使用共振光散射法检测蛋白酶A活性具有较高可靠性。

尽管荧光底物法有很高的准确度和很低的检测限，但是这种方法要求的底物很难得到，且价格昂贵。另外，底物要求非常严格的保藏条件，开封后有效期短。所以，这种方法很难在工业和实验室中应用。相反，RLS法使用酪蛋白作为底物，酪蛋白价格低廉，容易获取。所以，RLS法可以应用到发酵液和成品啤酒中微量蛋白酶A活性的检测，不仅在实验室中，而且在工业上也有较大的应用潜力。

图2 RLS法和荧光底物法的相关性Fig.2 The correlation of RLS method and Fluorescent Substrate method

3 结论

本文从标准曲线、精密度、检测限、实际样品的测定等方面，对现有的蛋白酶A活性检测方法与本研究组建立的RLS法进行了比较。结果显示，与UV法、Lowry法、Bradford法相比，RLS法的精密度高（RSD=1.95%），标准蛋白浓度在1～500μg/mL之间时，标准曲线的线性良好（R2=0.9974），检测限可达到0.662μg/mL，并且在实际样品的检测中具有明显优势。对RLS法进行验证，结果显示，此方法的测定结果准确可靠，与荧光底物法测定结果之间的相关性系数为0.9917。因此，RLS法对啤酒发酵过程中蛋白酶A活性的测定优于其他方法，在实际啤酒生产过程中具有较大的应用潜力。

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